miR-101在口腔鳞状细胞癌中表达及对细胞增殖与侵袭的影响

杨珊 汪茂青 何科

(1川北医学院附属医院，四川 南充 637000；2成都医学院附属第二医院；3成都市第七人民医院)

口腔鳞状细胞癌是一种常见的口腔颌面恶性肿瘤，约占人口腔恶性肿瘤80%以上。遗传因素、外部环境等相互作用导致了口腔鳞状细胞癌的发生与发展，主要表现为癌基因的激活与抑癌基因的失活〔1～3〕。miRNA是一类能与靶基因的3′-非翻译区(UTR)特异性结合的非编码RNA分子，进而在转录水平上调控靶基因表达，参与细胞的生物学行为。目前人体已经发现了超过2 000种的miRNA，miRNA可作为癌基因或者抑癌基因参与肿瘤的发生发展〔4，5〕。miR-101是近期发现的一种在口腔鳞状细胞癌中低表达的miRNA〔6〕，且研究还发现miR-101与肿瘤细胞的上皮间充质转分化(EMT)密切相关〔7〕，提示miR-101与肿瘤的侵袭转移有重要关系。本研究探讨miR-101对口腔鳞状细胞癌KB细胞增殖与侵袭的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1细胞株 KB细胞购于中国科学院细胞库，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5%CO2条件下培养。

1.2试剂与仪器 DMEM培养基，胎牛血清购于美国Gibco公司；兔抗人锌指结合蛋白(ZEB)1及GAPDH多克隆抗体购于美国Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购于南通碧云天生物技术有限公司；重组质粒pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt及pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut购于广州锐博生物技术有限公司；miR-101 mimics、miR-101NC购于上海吉马生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒，LipofectamineTM3000脂质体，反转录试剂盒(第一链cDNA合成试剂盒)购于大连宝生生物技术有限公司；细胞周期试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司。Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度计购于美国Thermo公司；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；Epics-XLⅡ流式细胞仪购于美国Beckman Coulter公司。

1.3细胞转染 室温条件下Opti-MEM培养基分别稀释LipofectamineTM3000、miR-101 mimics及miR-101NC，将Opti-MEM培养基稀释好的LipofectamineTM3000分别与Opti-MEM培养基稀释好的miR-101 mimics及miR-101NC混匀，在室温下放置30 min，使其形成miRNA-LipofectamineTM3000复合物。接着将复合物加入生长融合度达到70%左右的KB细胞中，培养6 h，换新鲜培养液培养至48 h，最后采用Realtime-PCR法检测细胞中miR-101的表达。

1.4Realtime-PCR法检测细胞中miR-101表达 按“1.3”转染KB细胞，收集细胞，并根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA，焦碳糖二乙酯(DEPC)水溶解RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度，当检测出的RNA纯度(OD260 nm/OD280 nm=1.8)良好时候，根据反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，反应条件：30℃ 6 min，40℃ 20 min。最后进行 Realtime PCR 分析，预变性95℃，15 min；变性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40个循环。用2-△△Ct法分析miR-101表达量。

1.5MTT法检测细胞活力 将KB细胞平铺于96孔板，待细胞贴壁后，按“1.3”转染细胞并培养48 h，加入MTT孵育4 h后去除上清液，每孔细胞中加入150 μl的二甲基亚砜于微量震荡仪震荡10 min，于酶标仪560 nm处测定OD值。

1.6细胞克隆形成实验检测细胞克隆能力 将KB细胞平铺于96孔板，待细胞贴壁后，按“1.3”转染细胞并培养48 h，磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻洗涤2次，加入4%多聚甲醛固定10 min，加入Gimsa染液染色15 min，显微镜下观察。

1.7流式细胞术检测细胞周期 将KB细胞铺于6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3”转染培养48 h，每组收集1×106/ml个细胞，按流式细胞周期检测试剂盒说明书，加入Rnase混匀孵育1 h，再加入碘化丙啶(PI)染液孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.8transwell法检测细胞迁移能力 用DMEM培养液稀释Matrigel胶，并将稀释好的Matrigel胶平铺于8 μm的transwell小室的上室，下室加入10%胎牛血清的培养基。将按“1.3”转染培养24 h的单细胞悬浮液接种于transwell上室，培养48 h后，取出小室。Transwell上室的细胞用棉签轻轻擦去，下室用多聚甲醛固定细胞，并用1%结晶紫染色5 min，200倍显微镜下观察穿过滤膜的细胞并计数，取平均值，即为细胞的侵袭数目。实验重复3次。

1.9Western印迹检测细胞中ZEB1蛋白的表达 按“1.3”转染细胞48 h后，收集细胞并加入细胞裂解液在冰上裂解细胞，4℃离心，收集上清液。BCA试剂盒检测蛋白浓度，取30 ng蛋白样品上样，进行12%十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，转聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的牛血清蛋白(BSA)溶液室温下孵育1 h，兔抗ZEB1及GAPDH多克隆抗体溶液4℃过夜孵育，第二天室温孵育二抗，最后根据化学发光免疫试剂盒说明书在凝胶成像系统中曝光各蛋白条带，并分析条带灰度值。实验重复3次。

1.10荧光素酶报告基因表达分析 将miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt，miR-101 NC+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt，miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut，miR-101 NC+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut四组miR-101与ZEB1的重组载体转入KB细胞中，并根据双荧光素酶检测系统检测每组细胞的荧光素酶活性，计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。

1.11统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1miR-101 mimics转染情况的测定 与miR-101 NC组(0.32±0.03)比较，miR-101 mimics组miR-101表达量(1.45±0.14)显著上升(P=0.000)。

2.2miR-101对KB细胞活力、细胞克隆形成能力的影响 与miR-101NC组比较，miR-101 mimics组细胞活力显著降低、细胞克隆数目显著减少(P=0.000)，见表1。

表1 miR-101 mimics对KB细胞活力、细胞克隆能力的影响

2.3miR-101对KB细胞周期的影响 与miR-101NC组比较，miR-101 mimics组G1期显著延长，S期和G2期均显著缩短(P=0.000)。见图1、表2。

图1 miR-101对KB细胞周期的影响

表2 miR-101对KB细胞周期的影响

2.4miR-101对KB细胞侵袭能力的影响 与miR-101NC组〔(185.32±18.94)个〕比较，miR-101 mimics组细胞侵袭数目〔(48.73±4.87)个〕显著减少(P=0.000)。见图2。

图2 miR-101对KB细胞侵袭能力的影响(HR，×400)

2.5报告基因分析 miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt组荧光强度显著低于其他所有转染组(P=0.000)。见表3。

表3 报告基因分析

2.6miR-101对KB细胞中ZEB1蛋白及mRNA表达的影响 与miR-101NC组(1.00±0.10、0.43±0.04)比较，miR-101 mimics组ZEB1 mRNA和蛋白表达量(0.25±0.02、0.10±0.01)中显著下调(P=0.000)。见图3。

图3 miR-101对KB细胞中ZEB1蛋白表达的影响

3 讨 论

近些年来已发现了2 000多种miRNA，并证实这些miRNA虽然仅仅占人类基因组的1%，却控制着人类将近30%基因的表达。miR-101是仅存在于脊椎动物中的高度保守的miRNA，存在两个前体，分别为miR-101-1及miR-101-2，分别定位于人1号和9号染色体中。研究显示miR-101通过作用于丝氨酸/苏氨酸激酶(PKC)，进而调控细胞的增殖与分化，还能够调控依赖PKC的Polycomb抑制复合物2及甲基化的核小体组蛋白的表达水平，进而参与肿瘤的发生发展〔8〕。而且Miao等〔9〕研究表明miR-101基因多态位点(rs578481、rs705509)与口腔鳞状细胞癌发病风险密切相关。Troiano等〔6〕采用meta分析1 200例来自亚洲的口腔鳞状细胞癌患者中miRNA的表达，结果表明肿瘤组织中miR-21，miR-455-5p，miiR-155-5p，miR-372，miR-373，miR-29b，miR-1246，miR-196a及miR-181等9个miRNA表达量上调，miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17及miR-125b等7个miRNA表达量下调，且这16个miRNA的差异性表达与患者的总生存率及无病生存率密切相关，提示这些特异性miRNA的表达量能够预示口腔鳞状细胞癌患者的预后。本研究说明miR-101 mimics对KB细胞增殖具有抑制作用。肿瘤细胞的无限增殖与细胞周期的不可控制密切相关，miR-101 mimics能显著抑制KB细胞的侵袭能力。

miRNA主要通过与靶基因mRNAUTR配对结合，进而降解或者抑制靶基因转录，调控靶基因转录，进而影响细胞的生物学行为〔10～12〕。ZEB蛋白是一种核转录因子，包括ZEB1及ZEB2两个成员。其中ZEB1定位于人10号染色体短臂，可转录高达32种的miRNA〔13，14〕。研究显示ZEB1是EMT重要的调控因子，能促进EMT的发生。另外研究也显示miR-101与EMT密切相关，miR-101能够通过调控ZEB1表达抑制肺癌细胞的增殖与转移，提示ZEB1可能是miR-101的下游靶基因〔7，15〕。本研究说明ZEB1是miR-101下游靶基因，miR-101通过负性调控ZEB1表达进而抑制KB细胞增殖与侵袭。