唾液腺癌分子病理诊断进展

夏荣辉， 李 江

（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科，上海 200011）

唾液腺癌是一组在组织形态学上呈现异质性、重叠性的肿瘤，给病理诊断带来了挑战，而且不同组织学类型的肿瘤、同一肿瘤中不同亚型的生物学行为不同，治疗策略亦不同，尤显正确病理诊断的重要性。 近年来，唾液腺癌的分子检测取得了巨大的进展[1-2]，越来越多的遗传学改变、尤其是融合基因被发现，并且这些遗传学改变存在着肿瘤类型特异性或相对特异性，有些改变还可导致相应蛋白表达的变化。 因此，这些变化对肿瘤的病理诊断起着重要的辅助作用。 此外，这些遗传学改变对于唾液腺癌的命名、分类及新类型肿瘤的发现正在或将会产生重要的影响。 本文对近年来发现的唾液腺癌中的重要遗传学改变进行介绍，这些遗传学改变不但可以作为唾液腺癌病理诊断强有力的工具、帮助优化肿瘤分类，还可能作为预后标志物或应用于肿瘤靶向治疗。 目前，其中的一些遗传学改变已被证实是治疗靶点。

1 腺样囊性癌

腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma, ACC）中最常见的融合基因是MYB-NFIB（33.0%~85.6%）[3-5]、MYBL1-NFIB（10.0%~22.0%）[5-7]，以及 NOTCH1 突变（5%~27%）。 MYB-NFIB、MYBL1-NFIB 融合基因可导致肿瘤中的 MYB、MYBL1 表达升高，MYB 的免疫组化检测有助于ACC 的肿瘤诊断， 但特异性不强。 我们推荐临床利用荧光原位杂交（flourescence in situ hybridization, FISH）技术，用 MYB 分离探针检测辅助ACC 的诊断（图1）。 近期研究表明，复发/转移性腺样囊性癌的肿瘤组织富集Notch 通路基因（包括 Notch1、2、3、4）变异和染色体重塑基因（KDM6A、KMT2C 等）变异；肿瘤中端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）启动子突变与 Notch1 突变、MYB/MYBL1 融合互斥， 提示发生TERT 启动子突变者为腺样囊性癌中的独特亚型。TERT 启动子突变是独立于MYB、Notch1 通路的肿瘤发生替代机制。 复发/转移性腺样囊性癌可分为4 种 分 子 分 型 ：MYB+Notch+、MYB+/other、MYBWTTERT+及 MYBWTNotch+， 其中 MYB+Notch+和 MYBWTNotch+分型预后最差[8]。 虽然 MYB/MYBL1 是 ACC中最常见的异常基因，但尚无靶向药物，且40.3%的复发/转移性腺样囊性癌存在潜在的酪氨酸激酶抑制剂靶点[8]。 由于腺样囊性癌中存在着一定比例的Notch 突变，针对Notch 的激活性突变，目前正在开展γ-分泌酶的小分子抑制剂AL101 的Ⅱ期临床试验。

图1 腺样囊性癌组织学表现、MYB 蛋白表达和MYB 基因分离探针FISH 检测Figure 1 The histological features, MYB expression and FISH detection of MYB gene rearrangement of adenoid cystic carcinoma

2 黏液表皮样癌

黏液表皮样癌（mucoepidermoid carcinoma,MEC）中最常见的融合基因是 CRTC1-MAML2、CRTC3-MAML2 和 EWSR1-POUSF1。 CRTC1-MAML2 的发生率为34%，CRTC3-MAML2 发生率为 6%。 CRTC3-MAML2 与 CRTC1-MAML2 是相互排斥的， 出现CRTC3-MAML2 患者的平均年龄（36 岁）比出现CRTC1-MAML2 者（58 岁）更年轻，并且出现 CRTC3-MAML2 融合基因的黏液表皮样癌预示着较好的生存率，而EWSR1-POUSF1 融合基因多见于高级别的黏液表皮样癌[1]。 TP53、POU6F2 是黏液表皮样癌中最常见的突变基因[9]。 有学者借助于CRTC1-MAML2 融合基因的检测，发现了Warthin 瘤样黏液表皮样癌这一独特亚型[10]。 在临床实践中，通过淀粉酶消化后，过碘酸希夫反应（periodic acid Schiff,PAS）和阿辛蓝染色可以确定肿瘤中是否含黏液细胞，同时建议用MAML2 分离探针的FISH 检测辅助黏液表皮样癌的病理诊断（图2）。

图2 黏液表皮样癌组织学表现、阿辛蓝染色和MAML2 基因分离探针FISH 检测Figure 2 The histological features, Alcian blue staining and FISH detection of MAML2 gene rearrangement of mucoepidermoid carcinoma

3 分泌性癌

分泌性癌（secretory carcinoma, SC）也称乳腺样分泌性癌（mammary analog secretory carcinoma,MASC），是《2017 版 WHO 头颈肿瘤的唾液腺肿瘤分类》中新增加的类型[1]。 虽然此类肿瘤较为罕见，但肿瘤中的ETV6-NTRK3 融合基因却高达90%以上，是近年来最著名的NTRK 肿瘤之一。 分泌性癌中最经典的遗传学改变是出现ETV6-NTRK3 融合基因， 除了可以对此融合基因进行分子检测帮助诊断外，还可进行Pan-Trk 的免疫组化辅助诊断（图3）[11]。 近年来研究发现，少数分泌性癌中存在ETV6-RET、ETV6-MET、ETV6-MAML3、EGFR-SEPT14、VIM-RET、CTNNA1-ALK 等融合基因[12-16]，其中部分遗传学改变可作为酪氨酸激酶治疗靶点。 虽然大部分分泌性癌是低级别肿瘤， 但少数肿瘤可出现复发、转移，甚至可出现高级别转化（high-grade transformation）。本研究团队发现，在普通型分泌性癌中，高Ki67 增殖指数、侵袭性生长、淋巴结转移是该肿瘤预后差的风险因子。 在治疗方案的选择上，对于大多数普通型SC，手术彻底切除即可；对于侵袭性生长，尤其是Ki67 指数较高的SC，需彻底切除，密切随访；对于有淋巴结受累的普通型、伴高级别转化的SC，需彻底切除加颈淋巴结清扫[17]。 对于复发转移性或无法手术的分泌性癌患者， 可针对NTRK融合基因进行靶向治疗， 拉罗替尼（Larotrectinib）、恩曲替尼（Entrectinib）是分别被美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的口服型TRK 抑制剂，也是首批与肿瘤类型、患者年龄无关的肿瘤治疗的化学药物。 它们对于存在NTRK 融合基因的肿瘤（分泌性癌、婴儿纤维肉瘤、甲状腺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤等）的总体缓解率达75%[18-20]。

图3 分泌性癌组织学表现、Pan-Trk 蛋白表达和ETV6 基因分离探针FISH 检测Figure 3 The histological features, Pan -Trk expression and FISH detection of ETV6 gene rearrangement of secretory carcinoma

4 透明细胞癌

唾液腺透明细胞癌（clear cell carcinoma, CCC）是一种较为罕见的肿瘤。 最近的研究发现，该肿瘤中存在EWSR1-ATF1 融合基因。由于透明细胞癌中常见透明细胞、不典型鳞状细胞，所以有时需要和黏液表皮样癌进行鉴别诊断。 黏液表皮样癌中常见较大的囊腔，腔面内衬成簇的黏液细胞，组织学上常见更高级别，MAML2 分离探针FISH 检测阳性。透明细胞癌中可见散在的黏液细胞，但肿瘤常缺乏囊性特征， 肿瘤边界呈侵袭性，CK7 免疫组化染色呈弥漫强阳性表达，可利用EWSR1-ATF1 融合探针进行 FISH 检测辅助诊断（图 4）[21]。

5 多形性腺癌

在《2017 年WHO 唾液腺肿瘤分类》中，之前的“多形性低度恶性腺癌”中的“低度恶性”被删除，肿瘤被更名为 “多形性腺癌”（polymorphous adenocarcinoma, PAC）[1]。 多形性腺癌最常发生于小唾液腺，特别是腭部；肿瘤细胞形态单一，但呈现多样的组织生长模式，特征性的结构为单排、窄梁状流水样柱状细胞形成同心圆的螺旋结构， 还可出现管状、簇状、实体、筛状、乳头状等结构，约3/4 的多形性腺癌中存在 PRKD1 热点激活性突变（E710D）[22]。 另外一个与多形性腺癌类似的肿瘤为“（小）唾液腺筛状腺癌”（cribriform adenocarcinoma of salivary gland，CASG）。在《2017 年 WHO 唾液腺肿瘤分类》中，它被列为“多形性腺癌”的一个亚型，但许多学者认为，这两者在临床、形态学、分子改变上有显著的不同，应该是两个独立的肿瘤类型。（小）唾液腺筛状腺癌最多见于舌根，常呈乳头状、肾小球样、筛状生长模式，肿瘤细胞呈泡状核， 细胞核与甲状腺乳头状癌的细胞核非常相像， 约70%的患者在诊断时已发生区域淋巴结转移。（小）唾液腺筛状腺癌的分子改变与多形性腺癌在同一位点，但基因变化显著不同。 （小）唾液腺筛状腺癌中出现的是PRKD1-3 的基因重排，伙伴基因为ARID1A 和DDX3X，这和多形性腺癌有显著不同，可用来鉴别诊断两者[23]。

图4 唾液腺透明细胞癌组织学表现、CK7 蛋白表达和EWSR1-ATF1 融合探针 FISH 检测Figure 4 The histological features, CK7 expression and FISH detection of EWSR1-ATF1 fusion of salivary clear cell carcinoma

6 导管内癌

在《2017 年WHO 唾液腺肿瘤分类》中，导管内癌（intraductal carcinoma, IDC）是新命名的肿瘤，之前被称为“低级别筛状囊腺癌”或“低级别唾液腺导管癌”[1]。IDC 具有与乳腺非典型导管增生、导管原位癌相似的特性，可以是低、中、高级别肿瘤，部分肿瘤中肿瘤细胞免疫组化结果为S100+、Mammaglobin+，这些特点与分泌性癌有重叠。 目前认为，导管内癌在组织形态上至少可以分为3 种亚型， 分别为闰管型（intercalated duct type）、顶浆分泌型（apocrine type）以及上述两种成分均有的混合型。闰管型多为S100+/AR-，而顶浆分泌型多为S100-/AR+，其他较少见的亚型为嗜酸细胞型（oncocytic）、不能分类亚型（unclassifiable）等，高级别肿瘤内更常见顶浆分泌细胞[24]。 导管内癌中最常见的融合基因类型为NCOA4-RET，其次为 TRIM27-RET[25-28]，较少见的类型为TUT1-ETV5、KIAA1217-RET[25]和 STRN-ALK[29]。 虽然此类肿瘤目前被命名为“导管内癌”，但其中有部分肿瘤常伴有局灶侵犯或广泛侵犯周围组织，故Skálová 等[26]提出，此类肿瘤是否应命名为“闰管癌，非侵袭性或侵袭性”（intercalated duct carcinoma,noninvasive or invasive）更为合适。此外，在低级别顶浆分泌型导管内癌中检测到HRAS、PIK3CA、 SPEN和ATM 突变， 这与经典型导管癌的分子遗传学改变类似[30]。

7 腺泡细胞癌

唾液腺腺泡细胞癌 （acinic cell carcinoma,AiCC）大多数为低级别恶性肿瘤。近期的研究发现，腺泡细胞癌中发生了 t（4;9）（q13;q31）易位，导致9q31 上的 NR4A3 基因表达上调，NR4A3 是腺泡细胞癌发生的驱动基因[31]。 有研究对64 例腺泡细胞癌 （其中17%伴高级别转化） 进行NR4A3 检测发现，肿瘤细胞核NR4A3（NOR-1）免疫组化标记显示很高的特异性（100%）和敏感性（98%），而NR4A3的FISH 检测敏感性相对较低（84%），在临床实践中，可将二者联合使用以辅助诊断（图5）。 而29 例分泌性癌和70 例其他肿瘤中， 肿瘤细胞核中NR4A3 免疫组化均为阴性。 因此，NR4A3 在腺泡细胞癌中是具有很高特异性和敏感性的标记，这在对伴有高级别转化的腺泡细胞癌、缺乏颗粒的腺泡细胞癌与分泌性癌进行鉴别时特别具有价值[32]。此外， 有4.4%~8.0%的腺泡细胞癌出现 HTN3-MSANTD3 融合基因[32-33]。 出现此种融合基因的肿瘤，常以浆液性腺泡细胞为主，实性型生长，无淋巴基质， 但此类肿瘤的生物学行为与其他类型的腺泡细胞癌并无不同[33]。 出现 HTN3-MSANTD3 的腺泡细胞癌，免疫组化标记均显示为NR4A3 胞核阳性[32]。

8 上皮-肌上皮癌

上皮-肌上皮癌 （epithelial-myoepithelial carcinomas, EMC）形态多样，除了经典的内层导管上皮、外层肌上皮结构外，还常可见筛状、基底细胞样、皮脂分化等结构，偶见嗜酸性细胞/顶浆分泌、乳头-囊状、双层透明、鳞状分化、砂粒体、伴高级别转化等结构。 82.7%的上皮-肌上皮癌会出现HRAS 突变，集中于密码子61。 其他较常见突变的是PIK3CA 和AKT1 基因，分别见于20.7%和6.5%的上皮-肌上皮癌中，并且后两种突变常伴发于发生HRAS 突变的上皮-肌上皮癌，而在其他唾液腺肿瘤，如腺样囊性癌、多形性腺瘤、基底细胞腺瘤/腺癌、肌上皮癌中均未见HRAS 突变， 提示HRAS 突变是辅助诊断上皮-肌上皮癌非常有价值的指标[34]。 上皮-肌上皮癌和腺样囊性癌均表现为内层为导管上皮、外层为肌上皮，在组织形态上有所重叠，有时可见同一肿瘤中同时存在两种结构的“杂交瘤”。 对29 例上皮-肌上皮癌（15 例经典型低级别上皮-肌上皮癌、7 例中级别上皮-肌上皮癌、2 例上皮-肌上皮癌伴肌上皮不典型增生、1 例上皮-肌上皮癌伴高级别转化、4 例伴腺样囊性癌成分的杂交瘤） 的分析发现，3/4的杂交瘤、2/7 的中级别上皮-肌上皮癌中存在MYB易位，在存在MYB 易位的杂交瘤中，上皮-肌上皮癌区域、 腺样囊性癌区域均存在MYB 的基因断裂；而在经典型上皮-肌上皮癌、上皮-肌上皮癌伴肌上皮不典型增生、上皮-肌上皮癌伴高级别转化中,均未检测到MYB 的基因易位。 因此，伴腺样囊性癌和上皮-肌上皮癌成分的杂交瘤，或具有高度侵袭性的上皮-肌上皮癌，其实质可能就是腺样囊性癌，而不是上皮-肌上皮癌[35]。

图5 腺泡细胞癌组织学表现、NR4A3 蛋白表达和NR4A3 基因分离探针FISH 检测Figure 5 The histological features, NR4A3 expression and FISH detection of NR4A3 gene rearrangement of acinic cell carcinoma

9 NUT 癌

NUT 癌（NUT carcinoma）是一种少见的、高侵袭性的差分化癌，因存在NUT 基因（15q14）重排而命名，其主要伙伴基因为 BRD4 基因（19p13）。 NUT 癌多见于年轻人，发病部位多见于中线部位，最早报道发生于胸腺、纵膈，上呼吸道、消化道多见。 2009 年Bakker 等首次报道了发生于唾液腺的NUT 癌，至今文献报道发生于唾液腺的NUT 癌仅有10 余例。该肿瘤细胞排列成条索状、巢状、黏附性差的片状，肿瘤细胞呈未分化样，为相对较为一致的小或中等大小的多角形细胞，肿瘤细胞核呈程度不等的染色质浓染，核仁不清或可见，胞质透明或淡嗜酸性染色，常见单细胞坏死/凋亡、灶性坏死，常见突然鳞化、导管样结构，偶见单个杯状细胞、导管样分化，间质水肿、黏液样或纤维样。 少见黏液玻璃样间质，其中见基底样肿瘤细胞巢， 易误认为原始病变为多形性腺瘤或基底细胞腺瘤。 免疫组化结果显示：NUT 细胞核阳性、p63 阳性，CKpan 不同程度阳性，FISH 检测示 NUT、BRD4 分离（图 6）。这些检测有助于将其与转移性分化差的鳞状细胞癌、高级别或去分化的唾液腺恶性肿瘤，如黏液表皮样癌、肌上皮癌、基底细胞腺癌、上皮-肌上皮癌、癌在多形性腺瘤中进行鉴别。 溴区结构域（bromodomain）抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂可能对该肿瘤的治疗有效[36]。

10 造釉细胞瘤样尤文肉瘤

造釉细胞瘤样尤文肉瘤（adamantinoma-like Ewing sarcoma, ALES） 存在尤文肉瘤中典型的EWSR1-FLI1 融合基因，肿瘤有明显的上皮分化。此类肿瘤最早报道见于长骨和胸腔，但大多发生于头颈部。 镜下见肿瘤呈显著侵袭性生长，侵犯周围唾液腺、纤维脂肪组织，肿瘤细胞巢之间有显著的纤维间质分隔，个别病例的间质伴黏液变。 肿瘤组织结构多样，呈巢状、梁状、分叶状排列，常见玫瑰花结（rosettes）结构，罕见周边细胞核栅栏样排列，罕见显著角化和突然鳞化，核分裂易见，可见灶性坏死，肿瘤细胞形态一致，含少量透明或嗜碱性胞质，胞核圆，染色质淡染，含单个显著核仁。 由于肿瘤细胞常呈基底细胞样， 应特别注意与基底细胞腺癌、腺样囊性癌、鳞状细胞癌、NUT 癌、大细胞神经内分泌癌、 肌上皮癌等相鉴别。 免疫组化结果示AE1/AE3、CD99、p40、NKX2.2 阳性，常见 Syn 阳性，存在EWSR1-FLI1 融合基因（图 7）。 由于其存在显著的上皮分化，故有学者认为这些肿瘤实际上有可能是“伴有 EWSR1-FLI1 融合基因的癌”[37-38]。

图7 造釉细胞瘤样尤文肉瘤组织学表现、NKX2.2 蛋白表达和EWSR1-FLI1 融合基因探针FISH 检测Figure 7 The histological features, NKX2.2 expression and FISH detection of EWSR1-FLI1 fusion of adamantinoma-like Ewing sarcoma

综上所述，近年来在唾液腺癌中，越来越多的肿瘤特异性遗传学改变被发现。 利用这些遗传学异常不仅可为唾液腺癌的精准诊断做出贡献，其中一些异常还可靶向遗传学变异，包括多个酪氨酸激酶抑制剂靶点，如 NTRK、RET、MET、EGFR 等。 因此，进一步加强对唾液腺肿瘤的分子病理研究，将为靶向治疗提供可靠依据。