miR-200s、SEC23A 在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的表达影响及与小气道重塑（SAR）相关性分析

朱敏，吴叶菊，高静，来依宁，卡米拉，陆建萍，韩擎明,黄丽欢

（克拉玛依市中心医院，新疆 克拉玛依）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以不完全可逆的气流受限为病变特征的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关，目前临床症状和肺功能是COPD 诊断与病情分级的主要依据，但易受年龄等因素影响，不能全面评估病情。在COPD的发生发展过程中，小气道重塑（Small Airway Remolding，SAR）形成是COPD 气流阻塞的主要病理学基础，是COPD 病变持续发展的关键因素。SAR 指的是气道结构发生病理性改变，其重要的一个病理学特点就是细胞外基质沉积，特别是成纤维细胞增生，胶原沉积。成纤维细胞是产生和维持细胞外基质的主要细胞成分。异常成纤维细胞激活可能是引起组织病理性重构的主要原因。本文旨在探究miR-200s、SEC23A 在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的表达影响及与小气道重塑（SAR）相关性分析，研究如下。

1 研究内容与方案

1.1 研究内容

观察miRNA-200s，SEC23A 在COPD 患者样本的小气道，以及WS 在体内外诱导的COPD 模型中的表达，分析该表达与SAR之间的相关性。

1.2 研究方案

a. 筛 选COPD 患 者 样 本，运 用 免 疫 组 织 学，RT-PCR 和Western blot 分别检测miRNA-200s 和SEC23A 的表达。

b. 分别在大鼠以及培养的气道上皮细胞中，用WS 诱导体内外COPD 模型，分别以正常空气吸入大鼠和生理盐水处理细胞为正常对照组，免疫组织学， RT-PCR 和Western blot 分别检测miRNA-200s 和SEC23A 的表达。

注：本实验室已经具备运用WS 在体内外建立COPD 模型技术和设备。

c. SAR 相关指标的检测，对于COPD 患者样本和大鼠肺组织，主要检测小气道壁厚度和胶原沉积：取各组肺组织，HE 染色，选取直径小于2mm 的小气道作为观察目标。400 倍镜下随机取四个视野/组，分别测量小气道基底膜长度（Pbm），基底膜界定面积（Abm）和小气道外膜周长界定的面积（Ao）。运用公式计算整个小气道面积（WAt）：WAt=Ao-Abm。小气道壁厚度为被Pbm 的平方校正的WAt 值。沉积的胶原量为被Pbm 校正的小气道周围胶原面积。对于体外实验，主要用Sircol assay 检测培养细胞分泌至培养上清中的Col I。

d. 运用相关统计学方法进行以上各组miRNA-200s 或者SEC23A 与SAR 指标之间的相关性分析。

2 实验结果

(1) 使大鼠吸入WS，在体内诱导COPD 模型( 分为20mg/L和40mg/L 刺激组)，以正常空气吸入大鼠为正常对照组，HE 检测显示与正常对照细织相比，WS 刺激组小气道上皮細胞排列紊乱，气道管壁明显增厚，并呈WS 浓度依赖性。免痠组织化学染色显示，与正常对照组织相比，WS 刺激组SEC23A 表达明显增加，而RT-PCR 结果显示 miRNA200c 表达呈現下降趋势，均呈WS 浓度依性。免荧光结果显示，与正常对照组相比，WS 刺激组气道组织中，Vimentin 表达增强，而E-cat 则失去正常的膜表达方式sircol soluble collagen assay 检别结果显示，WS 刺激组Collagen Ⅰ分明显增加，并呈WS 浓度依性。上述各实验中，WS刺激组与正常对照组相比具有统计学差异，P＜0.05。

(2)在培养的16HBE 中加入10mg/L WSC 体外诱导COPD 模型，以生理盐水处理的细胞为正常对照组，相差显微下，正常气道上皮细胞为立体、稍微凸起及细胞间紧密连接，WSC 刺激组细胞间隙增宽，失去细胞间接触，部分细胞发生长梭形，多角形改变。与正常对照组相比，细胞免疫荧光结果显示WSC 刺激组SEC23A 表达明显增加，上皮型标记蛋白E-cat 表达降低而间质型标记蛋白Vimentin表达增强，提示出现EMT 现象；RT-PCR 结果显示miRNA200c 表达下降，srolsoluble collagen assay 检测显示Collagen Ⅰ分沁明显增加。WS 刺激组与正常对照组相比具有统计学差异，P＜0.05。

3 讨论

根据世界卫生组织估计，在肺部疾病中占最大比例的COPD 被列为世界第四号夺命杀手，仅次于肿瘤、心脑血管疾病和艾滋病的发病率。COPD 是一种多因素的疾病，其患病率本身易受地理环境、社会经济、生活方式等因素的影响。COPD 是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和肺气肿，是一种常见的慢性疾病。与气道、肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关，致残率与病死率极高，严重危害患者生存状态。目前临床诊断COPD 主要通过常规肺功能检查，但其方法具有一定局限性，同一肺功能水平患者可能有不同临床表现、生存状态，对同一种治疗方法敏感性亦不同。

新疆地处我国西北部，气候干燥，冬季长夏季短，绿化面积少，周围绕沙漠，风尘大降雨少，并且新疆少数民族特有的烹饪和饮食习惯，造成了由生物燃料（木材、木炭、动物粪便、庄稼杆和其他植物）导致的大量烟雾污染。新疆这种特殊的地理环境和人文环境导致的大气污染，是引起该地区COPD 高发的不容忽视的客观因素。明确COPD 发病机制，探索和寻求新的COPD 治疗方法，干预和逆转疾病过程，提高人民生活质量的任务迫在眉睫。鉴于SAR 在COPD 发生发展中起着至关重要的作用，直接影响到患者的预后和生存质量，阻断SAR 病程已经成为当前国内外COPD 的研究热点。由于COPD病因机制较为复杂，单用某种化学药物作用相当有限，在2011 年底颁布的最新COPD 诊断，处理和预防的全球策略中，以糖皮质激素抗炎以及支气管舒张解痉剂为主要手段的治疗，对COPD 气道炎症具有一定的改善作用，但不能阻止肺功能长期下降的趋势，并且长期，大剂量使用糖皮质激素将出现严重的不良反应以及毒副作用。因此，在病变根本中寻求多靶点防止COPD，特别是从细胞和分子机制上干预SAR 的发生发展已经受到国内外学者的广泛重视。