不对称二甲基精氨酸在慢性肾脏病患者动脉粥样硬化发生和 发展中的作用

陈胜男，申 燕

西安交通大学医学院第一附属医院肾脏病医院肾脏内科，西安 710061

不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是由含精氨酸残基的蛋白质经蛋白精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PMRT）翻译后甲基化形成的[1]，可直接经肾脏排泄，也可经酶分解代谢清除。健康人血浆ADMA 浓度为（1.0±0.1） μmol/L，并随肾功能减弱而升高[2]。肾功能轻度异常时，ADMA 升高主要是二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）活性下降的结果，故慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）早期肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）正常时即已出现血浆ADMA 升高[3]。ADMA 是内源性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制剂，可与L- 精氨酸（L-arginine，L-Arg）竞争性结合NOS 而阻止一氧化氮（nitric oxide，NO）合成[2]，导致各器官灌注不良[4]，致肾缺血并诱导氧化应激和缺血再灌注损伤[5]，导致内皮功能障碍及动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发生和发展[6]，与CKD 患者心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）严重程度[7]及AS 风险[8]呈正相关，而CVD 是影响CKD 预后的最重要因素，也是CKD 的首位死因[9]。故早期检测CKD 患者体内ADMA 水平变化，不仅可用于预测CKD 进展，也可用于早期发现CKD 患者心血管并发症及AS 的发生和发展，从而采取早期干预措施，改善CKD患者的预后及生存质量。

1 CKD 患者体内ADMA 升高的机制

1.1 肾脏排泄减少

ADMA 相对分子质量较小，可自由通过肾小球滤过膜经肾脏排出，也可在肾脏经Nα-乙酰化作用，形成不对称性Nα- 乙酰二甲基精氨酸（asymmetric Nαacetyldimethylarginine，Ac-ADMA）后由肾脏排泄，故CKD 患者滤过排泄障碍时ADMA 排出减少，至CKD 无尿期时ADMA 及Ac-ADMA 的肾脏直接清除途径被完全阻断，导致血浆ADMA 升高。动物实验结果与人类不同，双侧肾切除后，小鼠血浆ADMA 水平变化不大，而Ac-ADMA 显著升高[10-11]。这可能是因为小鼠体内ADMA 浓度极低，而在肝脏、小肠、脾脏内发生乙酰化形成Ac-ADMA 后主要通过肾脏排泄，因此血浆ADMA 升高不显著，Ac-ADMA 仍显著升高。而由于人体内ADMA 浓度远高于小鼠，且人类仅有10%～20%的ADMA 直接经肾脏滤过作用后经尿排泄，约80%的ADMA 在肾脏经DDAH 分解为瓜氨酸和二甲胺而清除[11-12]，故目前研究一致认为人类肾脏对维持ADMA 稳态至关重要。

1.2 酶代谢异常

PMRT 代谢异常是CKD 患者ADMA 升高的原因之一。CKD 患者肾小球滤过屏障受损，蛋白漏出增多，机体抗氧化能力降低，加之慢性炎症的存在和氧化应激增强可致Ⅱ型营养不良，体内蛋白质处于高分解代谢状态，甲基化蛋白的水解速度加快，直接刺激PMRT 表达上调、活性增强[3]。PMRT 以S- 腺苷 - 甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，水解含精氨酸残基的蛋白质，催化精氨酸甲基化形成甲基精氨酸[1]，同时SAM 脱甲基形成S-腺苷同型半胱氨酸。精氨酸甲基化即将甲基转移到精氨酸多肽末端鸟嘌呤氮原子上与之连接。若连接1 个甲基称为单甲基精氨酸（monomethylarginine，L-NMMA），Ⅰ、Ⅱ型PMRT 均可催化此进程；若2 个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上即为ADMA，由Ⅰ型PMRT 催化；若每个氮原子都连接1 个甲基则为对称二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA），由Ⅱ型PMRT 催化。因此，每合成一分子ADMA 需SAM 脱2 次甲基产生两分子同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）。Hcy 既可直接抑制DDAH 酶致ADMA 降解减少，也可直接或通过氧化作用导致内质网应激[13]，诱发细胞凋亡，加速体内的蛋白水解，上调PMRT 基因表达，进一步促进精氨酸甲基化，从而促进ADMA 合成与释放。增加的ADMA 可进一步增强PMRT 活性，抑制DDAH 活性，形成正反馈使ADMA水平进一步升高。催化ADMA 生成的Ⅰ型PMRT 主要表达于心脏、平滑肌、内皮细胞，是参与蛋白精氨酸甲基化反应的主要成员（约占85%），在受到血管剪切力损伤和低密度脂蛋白增加时表达增多。CKD 并存的高血压可通过核转录因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB）途径使血流对血管壁剪切力增加致血管内皮损伤[14]，同时上调PRMT致ADMA 生成增加[6]。高脂血症时，脂蛋白增多可致Ⅰ型PMRT 表达增加，故上述CKD 代谢异常均可导致甲基精氨酸升高且以ADMA 升高最明显，升高的ADMA 可致血管钙化[15]，血管壁僵硬度增加而易受血流动力学损伤，致肾缺血性损伤而加重ADMA 清除及代谢障碍。

酶代谢异常的第二因素是DDAH 和碱性氨基酸转运蛋白 -1（cationic amino acid transporters-1，CAT-1）。DDAH能够水解循环中的ADMA[16]。因染色体基因编码不同，DDAH 有DDAH Ⅰ和DDAH Ⅱ两种亚型，其血管分布不同但生物活性相同。DDAH Ⅰ是降解ADMA 的主要亚型[17]，存在于富含神经源型NOS 的大脑、肺、肾脏组织中，其中肾脏是DDAH Ⅰ表达最高、活性最强的组织（主要在近端小管）[2,16]。DDAH Ⅱ主要存在于富含内皮型NOS 的心血管、胎盘、肾脏等组织中。动物实验表明，肾脏疾病时DDAH Ⅰ mRNA 及DDAH Ⅱ mRNA 表达均下调[18]，且CKD 与CVD 有共同的危险因素，CKD是CVD 的高危人群[19]。因此，CKD 患者经心血管系统合成的DDAH Ⅱ也明显减少，导致ADMA 代谢清除障碍，血浆ADMA 升高。研究[11]表明：内皮细胞DDAH 敲除小鼠的ADMA 较不敲除小鼠无明显差异，证实了DDAH 不仅存在于内皮细胞，也广泛存在于肝细胞、肾近端小管细胞和脂肪细胞。而CKD 患者在内皮功能不全的基础上常合并胰岛素抵抗致糖、脂代谢紊乱，故CKD 患者DDAH降低更加明显，体内ADMA 显著升高。DDAH 结构域中的游离半胱氨酸残基是DDAH 发挥催化活性的必需部分；而半胱氨酸中的氧敏感性巯基，在氧化应激条件下易形成二硫键致DDAH 被氧化而失活，阻断DDAH 活性位点与ADMA 的结合。CKD 患者氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）增高、肿瘤坏死因子α分泌增多、高Hcy、高血糖等可导致氧化应激增强的因素均可降低DDAH 活性[12]，抑制DDAH 对ADMA 的降解作用[3,5]。CAT-1 是 L-精氨酸和ADMA 跨膜转运的最主要转运载体，可将循环ADMA 摄取至细胞内被DDAH 降解。CKD 时CAT-1 表达下调致ADMA 转运、清除障碍，ADMA 升高。

酶代谢异常的第三因素是AGXT2。极少量内源性ADMA 也可被表达于肾小管髓袢升支粗段上皮细胞的肾脏线粒体酶丙氨酸-乙醛酸转氨酶2（alanine-glyoxylate aminotransferase 2，AGXT2）降解产生α- 酮基-δ- 二甲基鸟嘌呤戊酸（α-keto-δ-N,N-dimethylguanidino valeric acid，DMGV），这一作用在ADMA 含量正常时并不显著；而在ADMA 超负荷时，AGXT2可代偿性地增强表达和上调活性而发挥降解ADMA 的作用[20]。而CKD 患者ADMA 超负荷的同时肾小管AGXT2表达减少，AGXT2对ADMA的代偿性清除作用减弱，故CKD 患者ADMA 蓄积尤为 显著。

2 CKD 患者体内ADMA 升高致AS 的机制

血管内皮结构和功能完整性是决定AS 发生和发展的关键因素。血ADMA 升高是CVD 和内皮功能障碍的独立危险因素[21-22]，与AS 直接相关[11]，主要表现为血管内皮功能障碍、血管内膜慢性炎症、纤维组织增生以及血栓形成。

2.1 ADMA 抑制NO 合成

L-Arg 经NOS 分解形成NO。NO 是血管内皮依赖性舒张因子，是相对分子质量小、半衰期短且极不稳定的脂溶性气体分子生物自由基，可自由穿透细胞膜，与细胞内NO 内源性受体——可溶性鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase，GC）中的亚铁血红素结合，形成NO- 亚铁血红素 -GC 复合物，从而活化GC，催化鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）转化为细胞内第二信使环磷酸鸟苷（cyclic guanosine-3′,5′-monophosphate，cGMP），增强cGMP 依赖的蛋白激酶（protein kinase，PK）或蛋白激酶G（PKG）的磷酸化作用，使 Ca2＋敏感的钾通道磷酸化、K+外流，同时通过L 型电压门控钙离子通道抑制钙离子内流[23]，降低细胞内Ca2+浓度，导致平滑肌松弛、血管舒张及血流增加，抑制平滑肌细胞增殖，预防纤维化，抑制血小板聚集及白细胞黏附而抗炎、抗血栓，调节心肌收缩力及血压、血流分布，减轻血管血流剪切力所致内皮损伤，并可抑制脂蛋白氧化从而减少脂质沉积于血管内皮，抑制AS 的启动。NO 也可通过S- 亚硝基化作用[16]使半胱氨酸残基硝基化，激活转录因子NF-κB和AP-1 等信号分子，调节降解cGMP 的磷酸二酯酶5（phosphodiesterase 5，PDE5）的稳定性及G 蛋白偶联受体信号转导，抑制钙离子通道，减少舒张期钙离子外流，调节血管舒张反应，发挥抗AS 作用。

ADMA 可通过多种机制阻断NO 合成，影响NO 表达，抑制NO 活性，导致内皮舒张功能不全、血管壁压力负荷增加，血流动力学冲击直接导致血管内皮损伤，影响内皮源性血管活性物质的合成与释放，致NO 维持血管内皮细胞功能及抗AS 作用减弱，促发AS 进程。

生理情况下，NO 主要由内皮型NOS（eNOS）以L-Arg 为底物合成。L-Arg 主要由肾皮质近端小管合成，CKD 患者L-Arg 合成减少致L-Arg 来源减少，加之ADMA 是尿毒症毒素，可直接抑制胃肠道吸收L-Arg，高浓度的ADMA 也可竞争性抑制CAT 转运体，影响L-Arg跨膜转运而抑制细胞摄取、吸收L-Arg。以上均导致NO的合成原料L-Arg 缺乏，致NO 合成不足。

ADMA 也可通过竞争性抑制作用抑制NO 的合成释放，干扰NO 的生物活性。ADMA 与L-Arg 结构相似，具有相同的离子通道，是内源性NOS 抑制剂，可直接与L-Arg 竞争NOS 的结合位点及干扰脂联素对NOS 的激活而抑制NO 合成、释放。四氢生物蝶呤（BH4）是eNOS的辅基，eNOS 与BH4及L-Arg 偶联，促进内皮细胞合成NO。ADMA 升高可使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）介导超氧阴离子O2-与NO 反应生成过氧亚硝基阴离子，氧化BH4，也可促进三磷酸鸟苷环化水解酶降解，使BH4减少，导致eNOS 解偶联；电子在NOS的2 个催化位点之间流动减弱，不能催化L-Arg 的双电子氧化生成NO，而以分子中的氧为单电子受体生成O2-等氧自由基，在抑制NO 合成的同时加重氧化应激，使GC的血红素基团——还原血红素铁（Fe2+）氧化为血红素铁（Fe3+），血红素集团活性降低，与GC 解离；GC 对NO的敏感性降低，NO 与GC 结合受阻，抑制上述NO-GCcGMP 途径的抗AS 作用。O2-也可使NO 转变为过氧亚硝酸盐，氧化eNOS，使NOS 解偶联产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），使NO 合成进一步减少，导致内皮细胞功能紊乱，而内皮功能不全是AS 的始动环节[24]。

ADMA 还可通过正反馈机制促进肾功能恶化，加重NO 代谢紊乱而加速AS 进程。ADMA 损伤肾小球滤过膜，加重肾损害，引起肾小管周围毛细血管收缩和微循环障碍，诱发小管间质缺血致DDAH 表达减少[5]、肾慢性缺氧，促发肾小管间质纤维化，加速肾损伤致ADMA 进一步升高，导致NO 进一步降低而促进AS 发生和发展。

2.2 诱导氧化应激

氧化应激是抗氧化剂（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶）和ROS（如O2-、OH－或H2O2）之间平衡失调的表现。ADMA 可使 NOS 传递电子给氧产生过氧化物，导致氧化应激，且可浓度依赖性地增加O2-的生成，增强氧化应激的同时，所产生的ROS 可诱导NOS 解偶联[14]，使 NOS 从胞质膜转位至线粒体，增加线粒体蛋白硝化水平，导致线粒体合成障碍。而 ATP 减少可降低热休克蛋白90（HSP90）的活性，阻止HSP90-eNOS 相互作用，诱导eNOS 解偶联，加重线粒体功能障碍，氧化应激增强，产生更多的ROS。ROS 增加PRMT-1 并抑制DDAH 活性，进一步导致ADMA 增加[14]。

ADMA 可干扰肝脏X 受体α（liver X receptor α，LXR α） 的表达和活性而下调ATP 结合转运体A1（ABCA1）和ATP 结合转运体G1（ABCG1）的表达，从而降低胆固醇逆向转运能力，抑制ABCA1、ABCG1 对胆固醇的清除作用，并可激活NADPH 氧化酶/ROS 途径抑制胆固醇代谢，导致高脂血症及动脉壁胆固醇沉积[25]。高脂血症、ADMA 升高均可使机体氧化应激增强，诱导低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）内大量多价不饱和脂肪酸在过量氧自由基的作用下发生过氧化反应，生成丙二醛（malondialdehyde，MDA）。MDA与载脂蛋白B（Apo-B）中的赖氨酸残基结合发生化学修饰，被氧化修饰为ox-LDL。ox-LDL 可直接剂量依赖性地抑制NOS 表达，抑制NO 合成[26]，也是氧化应激的生物标志物。磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）是ox-LDL 的主要活性成分，具有强细胞毒性，可直接损伤血管内皮，导致内皮功能不全，比极低密度脂蛋白胆固醇有更强的致AS 毒性。血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 -1（lectin-like receptor-1，LOX-1）是ox-LDL 的特异性受体，主要在内皮细胞表达，可特异性结合、吞噬ox-LDL，同时也含有NF-κB 的结合位点。升高的ox-LDL 可致NADPH 氧化酶活性升高，上调PRMT 基因表达并抑制DDAH 活性，致ADMA 合成增多、分解减少（且无法被抗氧化剂抑制）。ox-LDL 与ADMA 增加均可增强LOX-1的表达，诱导LOX-1 与ox-LDL 结合，激活丝裂素活化的蛋白激酶，并激活与AS 进程直接相关的NF-κB 途径，活化单核细胞趋化蛋白1 （monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）[27]和T 细胞趋化因子，从而诱导内皮细胞炎症因子表达，促进趋化因子及细胞黏附分子等合成[26]，趋化白细胞聚集并贴壁黏附于内皮下病灶部位，致局部炎症及内皮损伤、通透性增加，脂质渗入内皮下，同时单核细胞迁移进入受损的血管内皮下层并增殖分化为巨噬细胞，形成ADMA 所致的ox-LDL 诱导的巨噬细胞聚集效应[25]。巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，沉积于血管内膜，导致内膜下脂质沉积，形成早期脂质条纹。上述形成的泡沫细胞又可进一步促进氧化应激，激活NF-κB、VCAM-1、MCP-1，导致内皮黏附、炎症纤维化（ADMA 致内皮细胞NOS 和Flk1 的表达减少，肌钙蛋白和纤维蛋白原表达增加，促使内皮细胞向平滑肌细胞和间充质细胞转化，破坏血管平滑肌的正常结构，致血管纤维化重塑、血管壁僵硬度增加），形成以“纤维帽”覆盖的脂质内核，即典型的AS 斑块。上述分泌因子也可刺激血管内膜下平滑肌细胞增殖，摄取脂质转变为泡沫细胞。血管平滑肌表型转化是AS 的病理生理基础，可启动AS 进程并引起血管狭窄。升高的oxLDL 也可下调DDAH 表达，致ADMA 代谢清除减少，ADMA 进一步升高，形成级联效应，加速AS 进程[25]。rs 9267551 基因多态性通过降低小C 等位基因的功能抑制DDAH 活性导致AS，从基因层面证实了ADMA与AS 具有同构性内在关联[28]。

ADMA 可上调血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ受体，致血管紧张素合成增加，从而增强血管内皮细胞氧化应激，减少PGC-1α 表达和线粒体合成而抑制DDAH 活性、增强PRMT 活性，致ADMA 水平升高，通过氧化应激产生自由基，直接损伤胰岛β 细胞，引起胰岛素抵抗致血糖、血脂及游离脂肪酸水平升高而再次增强氧化应激[3]，形成瀑布式正反馈致血浆 ADMA 持续性升高。氧化应激、炎症与ADMA 之间存在正相关，与L-Arg 存在负相关。氧化应激增强可破坏内皮细胞，促进脂质过氧化[3]。ADMA 可通过抑制 GC/cGMP 途径破坏肾小球滤过屏障，增加肾小球对白蛋白的通透性。白蛋白是抗氧化剂，低蛋白血症状态下抗氧化物质减少，机体抗氧化能力降低，氧化应激进一步增强。低蛋白血症状态可刺激肝脏代偿性合成脂蛋白增加，致高脂血症，人类脂细胞能合成并释放ADMA，进一步促进AS 发生和发展。

2.3 导致血管炎症反应

炎症细胞在动脉内膜下的募集是血管炎症反应的重要特征。ADMA 可通过上述ROS/NF-κB 通路激活单核细胞系统导致炎症反应，增加炎症因子释放，促进单核细胞黏附到受损的血管内皮，诱导血管炎症反应，启动AS。ADMA 也可促进白细胞介素 -8（interleukin-8，IL-8）的释放，上调 CXC 趋化因子受体2（CXC chemokine receptor 2，CXCR2）表达，促进趋化因子释放，趋化单核细胞黏附于血管内皮而导致血管炎症反应。炎症细胞因子也可刺激ADMA 生成和释放，炎症指标C-反应蛋白（CRP）与ADMA 的正相关性证实了ADMA 与炎症反应形成正反馈，加重ADMA 的血管炎症损害，加速AS 进程。

2.4 损伤血管内皮及抑制新生血管生成

ADMA 可通过尿毒素作用直接损伤血管内皮，导致内皮合成、释放血管活性物质减少，也可通过抑制NO合成、改变血流动力学、增强氧化应激致内皮屏障受损，巨噬细胞及中膜平滑肌细胞移行至内膜大量增殖形成泡沫细胞；同时，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 被释放入血，血小板和单核细胞与血管内皮细胞黏附及浸润，促发AS。起源于骨髓的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是造血和内皮功能的标志物，可受细胞因子、生长因子等刺激被动员至外周循环，修复损伤的内皮并促进新生内皮形成，维持内皮稳态。EPCs 的动员、分化受NO 及eNOS 调控。上述ADMA 影响NO 及eNOS 的机制，均可影响EPCs 的功能。作为内源性EPCs 抑制剂，ADMA 既可剂量依赖性地通过内质网应激途径激活caspase-3 而诱导EPCs 凋亡[29]，也可通过诱导氧化应激及ox-LDL 形成激活NF-κB 途径而致EPCs 凋亡[26]，从而抑制EPCs 运动、分化及迁移、黏附及扩增能力，抑制前体细胞增殖分化为新生血管内皮细胞，抑制受损血管内膜的修复能力，导致受损血管的再内皮化进程受损。AS 的危险因素均与循环EPCs 减少或功能障碍有关。肾脏分泌的促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是动员和分化EPCs 的主要调节因子。CKD 患者EPO 分泌减少，以及ADMA 升高均可导致EPO 抵抗[30]，EPCs 调节异常，血管内皮修复及再生能力受到抑制，这正解释了部分肾性贫血患者对EPO 治疗反应差的原因[31]。ADMA 也可直接抑制血管内皮生长因子生成并增加肿瘤抑制因子NF1 表达，从而抑制Ras 表达，影响细胞周期蛋白表达，导致血管内皮细胞增殖受损，血管修复能力降低、生成减少[32]。这也说明为何CKD 患者发生AS 的年龄较一般人群提前，且发生AS 后形成的侧支循环较非CKD 人群少，代偿作用弱，更易发生动脉缺血性病变。

2.5 细胞衰老

ADMA 可激活氧自由基p38 丝裂原活化蛋白激酶途径，介导内皮细胞炎症与氧化应激反应，增加ROS 水平而抑制端粒酶活性，促进内皮细胞凋亡，激活细胞衰老p53/p21 通路，加快血管内皮细胞衰老；也可通过增加微小RNA-21 水平，抑制抵御氧化应激损害的关键酶——超氧化物歧化酶2 的表达及通过减少NO 生成来抑制端粒酶反转录酶活性，导致端粒缩短，加速内皮细胞损伤及衰老，促进AS 发生和发展。ADMA 也可抑制 PI3K-AKT 通路，促进心肌细胞自噬分子beclin-1 蛋白表达，通过溶酶体途径降解蛋白和细胞器，浓度依赖性地增强心肌自噬活性，诱导心肌细胞凋亡，致心肌细胞数量减少，心肌舒缩功能障碍，心输出量减少，冠状动脉血供减少，产生冠状动脉缺血缺氧，致局部腺苷、乳酸等代谢产物堆积。腺苷通过激活肾小球入球小动脉上的腺苷A1 受体，减少肾血流量和GFR 并直接舒张外周血管致回心血量减少，心输出量进一步减少，导致全身严重而持久的缺氧，氧化应激增强。氧化应激所产生的ROS 类可进一步诱导细胞自噬，加速AS。细胞衰老时端粒长度的缩短也与CKD 进展直接相关[33]，致肾功能恶化，ADMA 进一步升高，通过上述机制加速CKD 患者AS 的发生和发展。由此可见，CKD 患者体内ADMA 升高对促发AS 发挥了重要 作用。

3 前景及展望

CKD 患者CVD 的高发生率和高病死率已成为威胁人类健康的重要疾病。通过动态监测CKD 患者ADMA 水平变化可预测早发AS，早干预，早治疗，改善疾病管理及患者预后，从而延缓CKD 进程，降低CKD 心血管疾病患者病死率。目前，测量ADMA 的方法尚未统一，不同人群的参考值范围尚不可量化，故在未来的研究中寻找简便及标准的ADMA 检测方法至关重要。同时，寻找与研发抑制ADMA 生成或拮抗ADMA 效应的特异性拮抗剂，用以改善内皮功能、保持NO 生物活性，有望成为防治CKD 患者心血管疾病的新途径。

参·考·文·献

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