基质金属蛋白酶-28 与特发性肺纤维化

2020-12-24严梅黄金霞杨朝

世界最新医学信息文摘 2020年26期

严梅，黄金霞，杨朝

（1.宁夏医科大学，宁夏银川；2.苏州科技城医院，江苏苏州）

0 引言

特发性肺纤维化( Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一种原因不明的慢性进行性纤维化性间质性肺炎，表现为渐进性呼吸困难和肺功能恶化，肺组织学和/或影像学表现为普通型间质性肺炎( usual interstitial pneumonia，UIP)[1]。IPF 的死亡率较高，中位生存期仅为3-5 年[2]。其发病机制尚不明确，目前认为肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AECs) 的损伤和异常修复，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常沉积以及纤维细胞的增殖和活化[3-5]共同参与IPF 的发病过程，导致肺部结构破坏和呼吸功能的丧失。

基质金属蛋白酶( matrixmetalloproteinases，MMPs) 是一类依赖于Zn2+和Ca 2+的蛋白水解酶，其催化活性位点中具有保守的锌结合基序，能够降解ECM[6]，且在细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成、组织再生和免疫应答中起重要作用[7]。基质金属蛋白酶-28 ( matrix metalloproteinase28，MMP-28) 是MMPs 家族中最新的成员之一，目前有关MMP-28 研究正处于起步阶段，对于MMP-28 的结构、表达、功能以及调节等机制尚未完全阐明。据报道，MMP-28 在皮肤癌、肝癌和某些心脏疾病(如急性心肌梗死和不稳定型心绞痛) 中表达上调[8-12]。而MMP-28 在IPF 的发生、发展过程中的作用及潜在应用价值尚未见报道，现对MMP-28 的结构、调节及其在肺纤维化中的作用进行综述。

1 MMP-28 的结构

MMPs 是一类结构上高度保守的锌依赖性内肽酶，至少包含三个结构域，信号肽与前肽区结构域、催化结构域以及通过铰链区连结的血红素结合蛋白样C 末端结构域，三个区域各有特殊功能[13-14]。MMP-28 最初是从人类角化上皮和睾丸的cDNA 文库中克隆而来，相对分子量为59Kd，可编码520 个氨基酸序列。对MMPs 的氨基酸序列进行对比后发现，MMP-28 与MMP-19 具有同源相似性，推断其为MMP-19 的一个亚族[15]。MMP-28 包含了所有MMP 典型的结构域，疏水信号肽结构域后紧接着包含PRCGVTD 的前肽结构域，前肽序列C 末端有一其独有的弗林蛋白酶激活序列RRKKR，表明MMP-28 可被弗林蛋白在细胞内激活[15-16]。MMP-28 的催化结构域是可溶性MMP 所具有的典型结构，但在催化序列HEIGHTLGLTH 中含有其他MMPs 所没有的苏氨酸[17]。另外还包括铰链区及其后的血红素样结构域。此外，MMP-28 的启动子在结构上具有特异性，其转录起始位点没有TATAbox 或cCAAT 序列，且具有“半胱氨酸开关”。MMP-28 的启动子需特异性结合sp 家族的转录因子GT-box 序列才能进一步启动其活性[18]。因此，与MMPs 中其它的成员相比，MMP-28 在结构上具有一定的相似性，但又有明显的不同之处，提示其在机体生理及病理过程内具有独特功能。

2 MMP-28 与特发性肺纤维化

IPF 是一种起始原因不明的异常生物学进程，过量的ECM 沉积于肺内，导致反复的AECs 损伤、肺组织修复以及周围血管新生重构异常，使肺泡正常功能丧失，最终引起肺组织变形、瘢痕组织形成及肺功能受损[19]。IPF 患者的血和肺组织中MMP-28 水平升高及肺纤维化动物模型的肺组织中MMP-28 含量增加均提示MMP-28 与肺纤维化相关[20,23]。另外研究还发现MMP-28 在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中表达上调，而MMP-28-/-小鼠不会出现肺纤维化表现，提示了它的促纤维化作用[20]。

2.1 来源

MMP-28 在人的基底部皮肤、基底上部的角化细胞、精原细胞以及神经细胞发育过程中高表达[15]。在肺内同样有着MMP- 28 群体的存在，在小鼠体外肺组织以及流感病毒感染模型中，已经证明MMP-28 由促进上皮细胞存活的Club 细胞表达[21-22]。而在IPF 患者肺组织中，免疫组化显示MMP-28 在AECs 表达强阳性，提示AECs 分泌MMP-28[23]。Maldonado 等人同样发现MMP-28主要由上皮细胞表达，特别是AECs 和支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells，BECs)，且定位于BEC 顶端和细胞质以及AECs 细胞质和核内[20,24]。

2.2 作用机制

2.2.1 促进炎症反应

在肺纤维化的早期炎症阶段，主要表现为上皮细胞脱落、炎症细胞浸润和细胞因子调控失衡，巨噬细胞是最早分泌炎症因子参与IPF 致病过程的细胞之一。按其功能可分为M1 型和M2 型，Ml 型分泌促炎因子和趋化因子，而M2 型分泌抗炎因子并清除肺内炎性细胞，发挥其抗炎作用，M1/M2 失衡参与肺部炎症反应的调控[25]。在一项动物模型试验中，敲除MMP-28 基因的小鼠肺组织MMP-28 表达水平下降，巨噬细胞M2 表型极化降低，且与野生型小鼠相比，博来霉素诱导的肺纤维化程度减弱[26]。Manicone 等人发现暴露于慢性香烟烟雾的MMP-28-/- 小鼠炎症反应减弱，且不发生肺气肿，部分原因可能是由于巨噬细胞M2 型水平降低，提示MMP-28 可促进肺部慢性炎症及组织重构[27]。为了阐述调控巨噬细胞表达MMP-28 的信号分子，研究人员用LPS 及 poly(I：C) 刺激巨噬细胞，发现MMP-28 表达增加依赖于TRIF- 和I 型IFN，且MMP-28-/-小鼠巨噬细胞中CCL 2、CCl 4、cxcl 10 和IL 6 的表达增加，提示巨噬细胞整合了TRF-和I 型IFN 依赖性信号通路通过调节MMP-28 的表达参与了ECM 的修饰[28]。

2.2.2 促进细胞增殖

反复的AECs 损伤和AEC 层的破坏可触发肺组织纤维化反应，受损的上皮细胞不能参与正常的组织重塑以及重建正常上皮屏障，且肌成纤维细胞的异常增殖以及循环细胞进入肺组织，促进了纤维化进程[29]。Saarialho 等人发现上皮细胞损伤后，TNF-α 通过NF-kB 通路产生的级联效应调节MMP-28 的产生[30]。此外，MMP-28 在AECs 中的过表达显著提高了其生长和增殖速率，与之相反的是，当MMP-28 基因沉默时，其生长和增殖率显著降低。同样，将人MMP-28 转染大鼠AECs 后，其生长和增殖率也显著升高。对于原代人BECs，沉默MMP-28 基因也观察到细胞生长和增殖率显著降低[20]。因此，MMP-28 在IPF 表达增加，并且以一种催化剂依赖的方式促进上皮细胞的增殖及表型的转化从而发挥促纤维化作用。

2.2.3 促进间充质转化

肺纤维化发病过程中的关键因素还包括肺泡上皮的损伤和成纤维细胞相互作用以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[31]。EMT 通过其上游相关信号通路引起纤维化效应，其中TGF-β 及其有关蛋白是最重要的细胞因子，而MMP-28可通过诱导TGF-β 的表达介导EMT 的发生，干预或阻断EMT 的相关效应分子，可抑制肺纤维化的发生发展，为延缓IPF 进展提供了一个新思路[32-33]。通过在A549 肺腺癌细胞中表达重组MMP-28，发现细胞表面E- 钙粘蛋白丢失，潜在TGF-β 复合物水解增多和活性TGF-β 水平的增加，均导致了稳定且不可逆的EMT，而MMP 抑制剂GM6001 或中和TGF- 活性的抗体可阻止导致EMT产生的一系列级联反应。一旦EMT 发生，细胞表型的转化不能被MMP 抑制剂逆转[34]。并且MMP-28 也可以通过激活Notch3 信号通路促进EMT 的发生[35]。

2.2.4 抑制细胞凋亡

细胞凋亡抵抗是肺纤维化进行性发展的重要原因之一，其中损伤的AECs 持续累积会影响细胞干性，从而出现细胞凋亡或衰老失控，另外在损伤修复阶段，肌成纤维细胞持续存在且存在凋亡缺陷，当衰老组织细胞不能被免疫细胞清除，大量累积并分泌细胞因子改变微环境，对肺纤维化有促进作用[36-38]。Manicone 等人在两个肺上皮细胞系(A549 和BEAS-2b) 中培育了正常表达的野生型和无催化活性的突变型MMP-28 细胞系，不论在血清剥夺或者使用蛋白酶抑制剂十字孢碱诱导细胞凋亡的实验中，观察到MMP-28 的过度表达对细胞凋亡具有保护作用。此外，与野生型小鼠相比，来自流感感染MMP-28-/- 小鼠的肺组织中caspase-3/7 活性增加，这种活性局限于气道上皮，但与病毒载量的变化无关。因此，确定了MMP-28 在促进肺上皮细胞存活中的新作用[22]。同样，在胶质瘤细胞中MMP-28 的上调通过激活TGF-β 来诱导细胞生长并减少胶质瘤细胞的凋亡。此外，TGF-β抑制剂则减弱了MMP-28 在胶质瘤细胞中的作用[39]。

2.2.5 促进细胞迁移

在各种损伤因素的刺激下，肺组织多种细胞被激活，经过上皮细胞基膜的间隙迁移至肺泡损伤处，并在该处沉积、增殖以及分泌ECM，启动损伤修复过程，最终导致肺纤维化[40-41]。在划痕愈合试验中高表达的MMP-28 增强了上皮细胞通过I 型胶原包被的Boyden 室进行的细胞迁移，且抑制钙粘蛋白的表达，促进纤维连接蛋白的表达，而用shRNA 沉默MMP-28 基因得到相反的结果。为了更深入了解其作用机制，用单氨基酸替代产生的无催化活性MMP-28 突变体则无增强细胞增殖和迁移的能力，因此IPF 中表达的MMP-28 可能以催化依赖的方式增强了上皮细胞的存活、增殖、迁移和EMT[42]。另外分子间伴侣Furin 通过与MMP-28 前肽结构域的YL 基序相互作用，可促进上皮细胞MMP-28 的分泌，将MMP-28 cDNA 转染COS-1 细胞后，细胞迁移能力增强，证明Furin 共转染促进细胞的迁移[43]。

3 MMP-28 抑制剂的应用

MMPs 的抑制剂主要分为两大类，一类为天然组织抑制因子-金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPS)。TIMP 是一种多基因家族的编码蛋白质，在ECM 降解调节中发挥重要的作用，分别为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，MMPS 与TIMPS 的平衡失调与肺纤维化的发生有关[44-45]。在肺纤维化动物模型中，TIMP-1 和TIMP-2 被诱导高表达[46]。对TIMPS 基因敲除小鼠的研究表明，TIMPS 可通过控制细胞功能来限制ECM 的沉积和减少ECM 的丰度[47-48]。博莱霉素诱导的TIMP1-/-小鼠其肺纤维化反应与野生型小鼠相比无明显差异，但TIMP1-/- 小鼠的炎症明显增加，提示TIMP1 在限制肺损伤后的炎症中起着关键作用[49]。因此，未来可将调控 MMPs 与 TIMPs 之间的平衡作为控制纤维化疾病的新靶点。

另外一类MMPs 抑制剂包括Kruppel 样因子9(KLF9)，KLF9是参与基因转录调控的锌指蛋白之一，通过多种信号途径以及与细胞内不同蛋白的相互作用，影响细胞的增殖及凋亡。KLF9 与MMP-28 的启动子区可特异性结合，实时定量PCR 和双荧光素酶试验表明KLF9 可直接抑制MMP-28 转录，而体内增强的MMP-28 表达可减弱由异位KLF9 引起的细胞侵袭和转移能力的降低，因此KLF9 通过抑制MMP-28 转录显著抑制细胞的侵袭和转移。将KLF9 应用于IPF 患者延缓肺纤维化的进程尚需进一步验证[50]。

同时，一些合成的MMP 抑制剂也被开发出来，但大多数为广谱抑制剂，同时对多个MMP 都有作用，并可能引起不良的肌肉骨骼副作用，导致其临床应用受限。目前多西环素是美国食品药品监督管理局批准的唯一一种MMP 抑制剂，将其应用于IPF 治疗尚未进行大规模的临床验证[51]。新一代的生物合成MMP 抑制剂可能显示出更高的MMP 特异性和更少的副作用，并且可能有助于针对特定的MMP，减少不受限制的组织重塑，从而用于MMP 病理相关疾病的治疗。