儿童慢性ITP外周血CD3+T细胞活性氧的检测及临床意义

宋 丽，杜宁超，李富荣（.深圳市人民医院转化医学协同创新中心，广州 深圳 5800；.深圳市第二人民医院肛肠外科，广州 深圳 58035）

特发性血小板减少性紫癜 (idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP) 是一种原因不明的自身免疫病，以血小板和巨核细胞自身抗体产生及成熟血小板破坏增多为主要病理特征,以及因此引起的皮肤、黏膜或内脏出血为主要临床症状的一类血液系统疾病[1]。ITP 患儿体内有T 细胞、B 细胞等的激活，白细胞分化抗原如CD3+(cluster differentiation，CD)T 细胞等。细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要在线粒体中产生[2]，具有较强的氧化能力[3]。总之，大量产生的ROS 对许多先天免疫细胞杀死吞噬的病原体至关重要[4]。在病理因素的诱导下这些吞噬细胞可以产生大量的ROS，吞噬细胞产生的ROS 可以到达T 细胞并导致氧化应激。在儿童慢性ITP 中，CD3+T 细胞的ROS 含量及其与儿童慢性ITP 的关系尚不明确。本研究以慢性ITP患儿及正常儿童的外周血为研究对象，分离外周血CD3+T 细胞来检测其ROS 的表达含量及ITP 与ROS 的关系，并探讨了ROS 作为 ITP 潜在诊断靶标的应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 见表1。收集我院 2018年 1月～2019年12月30 例慢性ITP 患儿外周血为试验组，其中男童14 例，女童16 例，年龄5.3±2.6 岁，诊断标准参考2016年版ITP 诊治的中国专家共识指南；对照组为同期经临床和实验室检查，证明无疾病的健康体检儿童外周血30 例，其中男童13 例，女童17 例，年龄5.4±2.0 岁。

表1 儿童慢性ITP 组和对照组一般资料比较（±s）

表1 儿童慢性ITP 组和对照组一般资料比较（±s）

类 别 慢性ITP 组（n=30）正常对照组(n=30) P体重指数 (kg/m2) 18.3±1.7 17.6±2.2 0.32心率（次/min） 85±7 81±8 0.27体温（℃） 37.2±0.6 37.1±0.8 0.85呼吸频率（次/min） 17±3 18±2 0.67

1.2 主要试剂和仪器 人CD3+T Cell Enrichment Column （美国BD 公司），anti-CD3-FITC，MsIgG1- FITC，D-Hanks 缓冲液（美国 Sigma 公司），淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品有限公司），2g/dl 台盼蓝染液、PBS 缓冲液(pH7.2～ pH 7.6)（自配），红细胞裂解液（美国 ThermoFisher公司），胎牛血清（FBS）（杭州四季清公司），BD-LSRFortessa（BD Biosciences），LD5-2A 型 低速水平离心机（北京医用离心机厂），电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），微量加样器（德国Eppendorf 公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血CD3+T 细胞纯度和活性检测:为了验证所提取的CD3+T 细胞的活性和纯度[5]，我们按如下方法操作：①取慢性ITP 患儿及对照组静脉血4 ml 抗凝，Hanks 液稀释1 倍，再加入淋巴细胞分离液中。②2 000 r/min 离心30min，液体分为三层，吸取上层和中层液界面处乳白色液体即为单核细胞。③该单核细胞37℃ 孵育30min，淋巴细胞悬浮，单核细胞贴壁，吸取悬浮液为纯化的淋巴细胞。④Hanks 液稀释此淋巴液5 倍，1 500 r/min 离心10min，弃上清液再裂解红细胞，弃上清。⑤经T 淋巴细胞分离柱(CD3+T cell enrichment column)过滤，得到纯化的T 淋巴细胞悬液。⑥1 500 r/min离心10min，Hanks 液重悬并细胞计数，计数后加入FBS 调整CD3+T 细胞浓度至2×106/ml。

CD3+T 细胞纯度检测：取细胞悬液100 µl，加2 µl FITC 标记的CD3+T 细胞单克隆抗体，充分混匀，4℃避光60 min，PBS 洗涤并离心2 次，加入200 µl 缓冲液，上流式细胞仪检测。

CD3+T 细胞活性检测：取20μl 细胞悬液加入20μl 2g/dl 台盼蓝染液，轻轻吹打均匀，加盖玻片，高倍显微镜镜检，正常活细胞不着色，折光强；死亡细胞被台盼蓝染成蓝色，体积膨大，据此计数判断CD3+T 细胞的活性。

1.3.2 流式细胞术（flow cytometry，FC）检测外周血CD3+T 细胞ROS：按试剂盒说明书操作，用FC 检测CD3+T 细胞ROS[6]。具体操作步骤如下：①荧光探针检测；②样品处理；③DCFH-DA（活性氧检测试剂）标记及检测；④上流式机检测分析。DCFH-DA 的荧光光谱和 FITC 非常相似，用 FITC的参数设置检测DCFH-DA。

2 结果

2.1 患儿血细胞检测结果 见表2。两组患儿的血细胞检测，发现除血小板有明显差异外（t=3.58,P＜0.05），其他血细胞检测指标差异均无统计学意义（t=0.89～1.20，均P＜0.05）。

表2 儿童慢性ITP 组和对照组血常规比较（±s）

检测指标 慢性ITP 组（n=30）正常对照组(n=30) P白细胞(×109/L) 6.1±2.0 6.7±2.8 0.24红细胞(×1012/L) 4.5±0.4 6.7±0.7 0.11血红蛋白（g/L） 133±11 156±9 0.09血小板(×109/L) 25.5±12.2 186.1±14.7 0.007

2.2 T 细胞存活率和纯度检测结果 我们运用FC检测CD3+T 细胞悬液纯度，镜下计数测得两组T细胞悬液试验组和对照组外周血T 细胞纯度分别为95.6%±2.4%，96.5%±1.3%；两组的T 细胞的存活率分别为97.3%±1.6%，96.0%±1.8%。两组的T 细胞纯度和存活率之间无统计学意义。

2.3 外周血CD3+T 细胞及其ROS 与正常对照组相比，试验组外周血CD3+T 细胞数量明显增加，差异有统计学意义（t=2.70，P ＜0.05），见图1。运用FC 检测CD3+T 细胞的ROS 水平，与正常对照组相比，慢性ITP 患者外周血相同数量CD3+T 细胞ROS 的水平明显增高，差异有统计学意义（t=2.45，P ＜0.05），见图2。FC 检测CD3+T 细胞ROS 的变化试验组平均荧光强度（Mean fluorescence intensity, MFI）为15.98±5.78，对照组为4.65±1.03，差异有统计学意义（t=2.956，P=0.003）。见图3。

图1 CD3+ T 细胞流式图

图2 FITC-CD3 单抗设门检测ROS

图3 ROS 荧光强度定量分析柱状图（CITP ∶慢性ITP）

2.4 慢性ITP 组外周血CD3+T 细胞ROS 水平与血小板的相关性分析 基于试验组ROS 明显升高和血小板降低，我们对二者的关系进行了分析。见图4 所示，慢性ITP 组外周血CD3+T 细胞ROS 的水平明显增高，而血小板数量明显降低，二者有相关性，呈负性相关（r2=-0.860 1，P ＜0.05）。

3 讨论

ITP 是一种自限性疾病，患儿大多在6 个月内可以痊愈，约10%～20%发展为慢性。ITP 高发年龄段为4～5 岁[7]，无明显性别和季节差异。ITP 血小板的破坏与淋巴细胞等的激活以及与抗血小板自身抗体的产生有关。研究也表明ITP 患者存在细胞免疫的异常，尤其与T 细胞功能改变有关，如CD3+T 细胞等。也有研究表明T 细胞识别人类血小板抗原(human platelet antigen，HPA)表位，进而活化产生细胞因子，激活B淋巴细胞产生自身抗体[8]破坏自身血小板。

图4 慢性ITP 组与ROS 与血小板的相关性分析

研究发现ROS 与ITP，炎症、肿瘤、自身免疫病等有关[9]。ROS 介导的信号传导涉及多个过程，如细胞生长、死亡[10-11]等。 ROS 可以细胞调控活化信号,进而影响血小板功能[12]。ST 段抬高型心肌梗死患者血小板中趋化因子CCL2 表达增高,通过NF-κB 信号通路影响血小板功能参与血栓形成[13]；ROS 在NF-κB 信号通路上游发挥作用激活IkB 激酶复合物（IKK），从其抑制剂（IkB）中释放NFκB，激活细胞相关的信号通路[14]。国内有研究表明T 细胞CD4+Th 亚群功能改变、异常激活和凋亡等，参与了ITP 血小板的破坏机制[15]。但CD3+T细胞的ROS 与儿童慢性ITP 的关系尚不明确。

本研究发现慢性ITP 患儿外周血CD3+T 细胞数量增加，其ROS 含量明显升高，同时伴有血小板数量的明显降低，发现ROS 和血小板二者之间存在负性相关关系，提示ROS 可能参与了慢性ITP血小板的破坏。根据我们的实验结果，可以推断在慢性ITP 中T 细胞特别是CD3+T 细胞可能被激活且产生大量ROS，ROS 作用在血小板的靶点可能是NF-κB 的通路如IκB，P65 或磷酸化P65 等，通过其氧化作用影响磷酸化或乙酰化作用，进而激活NF-κB 通路，加速了血小板的凋亡或坏死，最终导致患儿慢性ITP 的发生或发展。但ROS 可能抑制CD3+T 细胞的凋亡使其数量增加，这与我们的研究结果一致，但其机理需要进一步研究。B 细胞和中性粒细胞的ROS 可能也参与慢性ITP 的发展，在多种因素的共同作用下决定了ROS 对血小板的生成及破坏的影响，最终决定了慢性ITP 的转归与结局。

综上所述，慢性ITP 患儿外周血CD3+T 细胞的ROS 对血小板的破坏关系密切，可以作为慢性ITP 的诊断和治疗的潜在靶点，为临床工作提供一定的参考价值。同时，后续研究需进一步扩大样本量，研究ROS 对血小板信号通路及其结合位点的影响，以期更深入的研究ROS 对慢性ITP 血小板的破坏机制。