miR-29b对缺血损伤心肌细胞模型的自噬影响及分子机制研究

张 蕾，王 诚(.陇县人民医院心血管内科, 陕西宝鸡 700;.宁强县天津医院心内科 ，陕西宁强 74400)

心肌缺血再灌注损伤为常见的心血管病，为心肌组织缺血导致局部心肌损伤，由于机体自身的代偿机制实现缺血区域的再灌注，从而导致组织器官的进一步损伤[1-2]。该病的发生机制还不明确，涉及到免疫炎症损伤、线粒体损伤、细胞凋亡、氧化应激损伤、兴奋性氨基酸毒性等多种机制[3-4]。细胞自噬是指受损细胞器、错误折叠蛋白质产生的废弃物被自噬小体包裹起来，并运送到溶酶体中进行消化与降解。当细胞受到外界刺激处于应激状态时，自噬流被激活，可引起细胞内环境稳态紊乱，从而诱发心血管疾病的发生。微RNAs（microRNAs,miRNAs）在机体心血管疾病中有特定的表达谱，大鼠大脑中动脉栓塞模型中有上百个miRNAs 异常表达，说明miRNA 与心肌缺血再灌注损伤密切相关[5]。微RNA-29b(microRNA-29b, miR-29b)是一个与胚胎心血管系统的发育生长密切相关的miRNA，在心肌梗死大鼠中表达下降并可调节缺血性心肌损伤[6]。因此，本文探讨与研究了miR-29b 对缺血损伤心肌细胞模型自噬的影响及分子机制，旨在为缺血损伤心肌损伤的预防治疗提供新的途径和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 研究时间为2019年1～2019年12月，心肌细胞系(H9C2)购自中国医学科学院基础医学研究所，在温度为37℃，5%（v/v） CO2，湿润的细胞培养箱中孵育。

1.2 仪器与试剂 培养基为含10ml/dl 胎牛血清(中国康源生物公司)的DMEM 高糖培养基(美国Gibco 公司)；胰蛋白酶购于美国Millipore 公司；酶标仪购自美国BD 公司；蛋白杂交与凝胶成像系统购自美国Bio-rad 公司；蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗β-actin，乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)，微管相关轻链蛋白-3(microtubule associated protein light chain3,LC-3)多克隆抗体购自美国Abcam 公司；超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)与丙二醛(malondialdehyde, MAD)检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司;miR-29b 与miR-NC 购自上海吉玛生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 缺血损伤心肌细胞建立与分组：所有H9C2细胞先用PBS(Gibco 公司)清洗细胞2 次，加入用95%（v/v） N2+5%（v/v） CO2置换30min 的无糖DMEM，置于37℃，94%N2+1%（v/v） O2+5%（v/v）CO2低氧培养箱中缺氧培养8h，然后放入37℃，5%（v/v） CO2细胞培养箱给予复氧24h。将已经建立缺氧/复氧模型的H9C2细胞随机分为三组：空白组、对照组与实验组。

1.3.2 细胞转染方法：待细胞贴壁生长融合度达80%～90% 时，空白组、对照组与实验组以life2000TM为载体体外转染PBS，miR-NC 与miR-29b 等，转染后终浓度均为50nmol/L/孔，转染后4～6h 换液。

1.3.3 荧光定量PCR 检测方法：收集心肌细胞用Trizol 提取总RNA，逆转录后采用SYBR-Green 染料法进行定量PCR，反应条件为：95℃ 2min；95℃15s，60℃32s，40 个循环，检测结果以2-ΔΔCt值进行。

1.3.4 Western blot 检测方法：细胞收集后用PBS洗涤2 次，加入RIPA buffer 裂解细胞，蛋白样品定量后，于10g/dl SDS-PAGE 上进行分离，并电转至PVDF 膜上，采用5g/dl 脱脂奶粉封闭过夜，加入稀释到合适浓度的一抗，4℃孵育过夜，清洗后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，37℃孵育2h，清洗后采用化学发光检测底物，显影检测。

1.3.5 细胞增殖检测：将细胞消化后配成单个细胞悬液，调整好活细胞的浓度接种到96 孔板，培养24h 后每孔加入100μl 不同浓度的样品，培养特定的时间以后，每孔加MTT 溶液20μl，继续孵育4h 后吸弃上清液，每孔加150μl DMSO，振荡培养10min，选择490nm 波长，在酶标仪上测定吸光度，计算细胞增殖指数。

1.3.6 SOD 活力与MDA 含量检测：取细胞上清，采用酶联免疫法检测SOD 活力与MDA 含量。上述实验都重复3 次，取平均值。

1.4 统计学分析 选择SPSS20.00 软件对本研究所有数据进行分析，数据录入和处理均按照各个实验设计要求，符合正态分布的计量数据使用均数±标准差(±s)表示，两两对比采用t 检验，多组间对比采用单因素方差分析等，非正态分布数据采用非参数检验方法，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 miR-29b mRNA 表达及细胞增殖水平对比 见表1。 细胞转染后24h 与36h， 三 组miR-29b mRNA 表达水平、细胞增殖指数相比差异有统计学意义（P ＜0.05），其中实验组与空白组及对照组相比差异有统计学意义（P ＜0.05），空白组与对照组对比差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表1 转染后不同时间点miR-29b mRNA 表达及细胞增殖指数水平对比(±s)

注：*miR-29b mRNA 表达水平24h vs 36h ，t=59.566，P=0.000，差异有统计学意义。

指标 实验组 对照组 空白组 F P miR-29b mRNA 表达水平 24 h 56.33±10.11* 0.92±0.13 0.95±0.11 45.284 0.000 36 h 78.34±10.09 * 0.93±0.12 0.96±0.18 59.882 0.000细胞增殖指数 24 h 1.33±0.11 3.45±0.13 3.44±0.21 9.284 0.001 36 h 1.34±0.09 3.44±0.12 3.48±0.18 81.871 0.000

2.2 HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量及SOD，MDA 水平对比 见表2。细胞转染后24h 与36h，三组HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量及SOD 活力、MDA 含量相比差异具有统计学意义（P ＜0.05），其中实验组与空白组及对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，空白组与对照组对比差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表2 转染后不同时间点HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量及SOD, MDA 水平对比(±s)

表2 转染后不同时间点HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量及SOD, MDA 水平对比(±s)

注：*HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量24h vs 36h，t=7.048, 10.306, P=0.02, 0.009,差异有统计学意义。

指标 实验组 对照组 空白组 F P HIF-1α 24 h 4.54±0.33* 1.09±0.22 1.00±0.09 13.493 0.000 36 h 5.72±0.44* 1.34±0.16 1.21±0.11 12.898 0.000 LC-3 24 h 4.51±0.25 * 1.11±0.17 1.13±0.09 12.223 0.000 36 h 5.70±0.32* 1.37±0.18 1.32±0.09 15.693 0.000 SOD(U/mg) 24h 8.24±0.66 2.33±0.19 2.33±0.11 9.133 0.001 36h 8.56±0.51 2.49±0.18 2.28±0.09 9.672 0.000 MDA(µmol/g 24h 44.59±4.10 79.87±3.17 80.22±6.28 12.482 0.000 36h 44.09±4.41 80.09±3.19 80.98±5.67 10.093 0.000

3 讨论

心血管疾病是严重危害人体健康的主要疾病之一，具有死亡率高、发病危急、起病重和预后差等特点，其中心肌缺血/再灌注损伤为主要的心血管疾病[7]。当机体的心肌组织受到缺血等刺激时，可启动内源性抗氧化与抗缺血机制，保护濒临死亡的心肌细胞，促进心功能的恢复[8]。而在缺血再灌注过程中，损伤机制占绝对优势，保护性介质水平与持续作用时间有限，从而造成心肌组织的继发性损伤[9]。miRNAs 是一类长度约为23nt 的保守的小RNA，能够在转录后水平调控基因的表达，从而参与细胞生长、增殖、凋亡、分化的调控。miR-29b定位于染色体lq32.2，是在心肌缺血再灌注损伤中出现明显上调表达的miRNA 之一，在成肌细胞的增殖和分化的调节过程中起着中心作用，也可由各种各样的转录调节者和信号通路所调节[10-11]。有研究显示[12]，miR-29b 的过表达对心肌细胞具有保护作用，而低表达更易导致心血管损伤。

本研究显示细胞转染后24h 与36h，实验组的miR-29b mRNA 表达水平显著高于空白组与对照组，空白组与对照组对比差异无统计学意义(P＜0.05)。细胞转染后24h 与36h，实验组的SOD活力显著高于对照组与空白组(P＜0.05)，MDA 含量显著低于对照组与空白组(P＜0.05)，对照组与空白组对比差异无统计学意义(P＞0.05)。SOD 活力增加不但能显著减轻心肌组织损害程度，而且也具有重要的预防性脑保护作用，以及改善相关并发症[13]。而MDA 是细胞膜脂质被活性氧氧化后的副产物，MDA 含量降低可使得机体氧化应激损伤作用减少；而提高miR-29b 表达能清除心肌缺血再灌注损伤所产生的氧化应激产物，并提高抗氧化酶活性[14]。高英英[15]的研究显示，miR-29b 表达上调可减少缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡，与本研究结果一致。miRNAs 通过RNA 诱导的沉默复合体来调节靶基因的降解和/或翻译抑制。目前认为miRNAs直接调控哺乳动物基因组中1/3 以上基因的表达，特别是miRNAs 的异常表达与心血管病的发生发展密切相关[16]。本研究显示细胞转染后24h 与36h，实验组的细胞增殖指数显著低于空白组与对照组(P＜0.05)，空白组与对照组对比差异无统计学意义(P＞0.05)，表明促进miR-29b 的表达能促进心肌细胞增殖。

氧化应激是心肌缺血再灌注损伤的最主要因素，过度累积的氧自由基还可增加细胞通透性，引起钙离子内流发生交换障碍，诱发心律失常的发生。HIF-1α 是缺氧诱导因子家族的一员，在缺氧时上调表达以适应缺氧环境[17-18]。正常的心脏组织保留着低水平的自噬，保障细胞的能量与物质代谢。在心肌缺血再灌注过程中，自噬可导致心肌细胞降解过度，加重心肌损伤。过度激活的自噬流可加快心肌细胞的死亡，如何控制细胞自噬处于平衡的状态，使其向着保护心肌细胞的方向发展具有重要价值[19-20]。本研究显示细胞转染后24h 与36h，实验组的HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量显著高于空白组与对照组P＜0.05，空白组与对照组对比差异无统计学意义(P＞0.05)，表明miR-29b 的过表达可以调控HIF-1α，LC-3 蛋白的相对表达，从而影响心肌细胞的自噬与氧化应激水平。不过本研究没有明确miR-29b 的直接作用靶基因，对信号通路的调控分析不还够深入，下一步的实验将着重于相关信号通路分析。

总之，miR-29b 能通过正向调节HIF-1α，LC-3 蛋白的相对表达量来提高SOD 活性，降低MDA 含量，从而促进细胞自噬，发挥对缺血损伤心肌细胞的保护作用。