喉鳞癌组织中miR-1225-5p和CDC14B蛋白水平表达与临床病理特征及预后的关系

闫 娟，安 丽，张 杰，拓明祥（延安市人民医院,陕西延安 716000）

喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤，以鳞状细胞癌最为常见，手术是其主要治疗方式，然而晚期患者预后较差，放化疗耐药及术后局部高复发率是晚期患者死亡的主要原因[1]。因此，基于分子水平研究喉癌的发展具有积极意义。miRNA 是由19～24个核苷酸组成的短链非编码RNA，近年研究证实[2-3]，miRNAs 能够调控人类基因组中约60%的基因，在人类多种恶性肿瘤中表达异常，可通过调节肿瘤细胞生物学行为参与肿瘤的发生发展进程，作为致癌基因或抑癌基因发挥作用。miR-1225-5p 作为肿瘤抑制因子，最先于胃癌研究中被报道表达下调，与胃癌侵袭性表型及不良预后密切相关[4]。胶质母细胞瘤中miR-1225-5p 异常过表达可抑制细胞的增殖、侵袭及迁移，在癌组织中低表达与肿瘤恶性程度显著相关[5]。细胞分裂周期蛋白14B（cell division cycle 14B，CDC14B）是细胞周期重要调节因子，能够抑制癌基因的异常表达，防止细胞恶性病变[6]。据研究报道，乳腺癌、肝癌、卵巢癌等[7-8]肿瘤中均见CDC14B低表达，与肿瘤分化程度及病理分期相关。然而目前有关miR-1225-5p 和CDC14B 在喉癌中的表达作用尚不明确。因此，本研究对miR-1225-5p基因和CDC14B 蛋白在喉鳞癌组织中的表达及临床意义进行探究，现总结如下：

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2012年1月～2015年6月在我院行手术切除的67 例喉鳞癌患者癌组织及其配对的癌旁正常组织进行实验。入组患者均为原发病例，术前未接受任何放化疗治疗，临床病理资料完整；排除并发其他部位恶性肿瘤或存在严重脏器功能障碍及精神、认知功能障碍等病例。所有组织标本于液氮中低温保存，制成石蜡标本，用于后续研究。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情同意。

收集入组67 例喉鳞癌患者病例资料，包括：年龄40～79 岁，平均年龄57.3±7.2 岁，男性56 例，女性11 例；分化程度：高分化41 例，中低分化26例；颈部淋巴结转移36 例；T 分期：T1～T2 的 40例，T3～T4 的 27 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期38 例，Ⅲ～Ⅳ期29 例；喉癌发生部位：声门型43 例，声门上型19 例，声门下型5 例；既往有吸烟/饮酒史46 例；肿瘤直径：＜2cm 的35 例，2～4cm 的19 例，＞4cm 的13 例。术后对入组患者进行为期5年随访，以死亡或随访终止为研究终点，观察术后总生存情况。

1.2 试剂和仪器 Trizol 试剂购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR 仪购自瑞士Roche 公司；紫外分光光度计购自上海精科分析仪器厂；逆转录试剂盒购自TAKARA 公司；CDC14B 抗体购自美国Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 法检测miR-1225-5p mRNA 相 对表达：取组织样本研磨匀浆处理，采用Trizol 法提取总RNA，并检测其浓度及纯度，后按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，并以此为模板配置20 μmol/L PCR 反应体系，应用荧光定量PCR仪进行扩增反应，以GAPDH 为内参。引物序列由Invitrogen 设计合成，miR-1225-5p 上游：5’-ACAG TGCGGTCTACGCATGCGTTCGGTAGACAGTCG TAG-3’，下 游：5’-GCGACAGCTGCTTACGTAGG ATGCGCGCATAGCTTGCAG -3’；GAPDH 上 游：5’-GCATGTGATCGATGACAGTTATCAG -3’，下游：5’-GTCCTGATGATGCGTAGCATGATAGC-3’。 反应条件：95 ℃ 10 min 预变性，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，循环40 次，实验重复3 次取平均值。采用2-△△Ct法分析miR-1225-5p mRNA 相对表达。

1.3.2 SP 免疫组化染色法检测CDC14B 蛋白表达：取组织样本切片、脱蜡、水化，PBS 清洗，3g/dl H2O2阻断内源性过氧化物酶，枸椽酸盐缓冲液高压修复抗原；滴加正常山羊血清室温封闭20 min，加入一抗，4 ℃过夜；次日，加入生物素化二抗（IgG），37 ℃孵育20 min，PBS 清洗，加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素孵育20 min；DAB 染色，苏木素复染，脱水、透明，封片。鼠抗人PTEN 单抗、OTUD3 抗体购自Abcam 公司，SP 试剂盒、DAB显色液购自福州迈新生物技术开发公司，PBS 代替一抗作阴性对照。

结果判读：CDC14B 阳性判定为细胞浆内呈现棕黄色颗粒。根据阳性细胞数及染色强度进行半定量评分，于高倍镜下随机选取5 个视野进行阳性细胞计数，评分标准：染色程度：无染色（0 分），轻度染色（1 分），中度染色（2 分），强染色（3 分）；阳性细胞数计数：阴性（0 分），≤10%（1 分），11% ～ 50%（2 分），51% ～75%（3 分），＞75%（4分）。两积分和为0～2 分记为阴性表达，＞2 分记为阳性表达。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 进行数据分析处理，计数资料采用n（%）表示，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。癌组织及癌旁正常组织中miR-1225-5p 及CDC14B 表达比较采用配对样本t 检验和χ2检验；两者表达与临床病理特征的关系分析采用t 检验和χ2检验；K-M 法分析两者表达与预后的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉鳞癌组织及癌旁正常组织中miR-1225-5p 及CDC14B 相对表达比较 喉鳞癌组织中miR-1225-5p mRNA 相对表达水平显著低于癌旁正常组织（1.7±0.5 vs 5.9±1.6），差异有统计学意义（t=20.508，P＜0.001）。见图1A。CDC14B 蛋白阳性主要定位于细胞浆呈棕黄色，代表性图见图1B。喉鳞癌组织中CDC14B 蛋白阳性率（76.1% vs 37.3%）高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（χ2=20.550，P＜0.001）。

图1 miR-1225-5p 及CDC14B 在喉鳞癌组织中的表达

2.2 miR-1225-5p 及CDC14B 表达与喉鳞癌临床病理特征的关系 见表1。根据免疫组化结果将入组患者分为CDC14B 阳性组（n=51）和阴性组（n=16），经分析miR-1225-5p 及CDC14B 表达与临床病理特征的关系，结果显示：miR-1225-5p mRNA 不同表达在喉鳞癌患者分化程度（χ2=3.824，P=0.000）、T 分期（χ2=1.859，P=0.034）、TNM 分期（χ2=3.597，P=0.000）及是否淋巴结转移（χ2=2.191，P=0.016）之间的差异具有统计学意义。CDC14B 蛋白不同表达在喉鳞癌患者肿瘤直径（χ2=5.060，P=0.025）、分化程度（χ2=6.125，P=0.013）、T 分期（χ2=10.129，P=0.001）、TNM 分期（χ2=8.114，P=0.014）及是否淋巴结转移（χ2=4.273，P=0.038）之间的差异具有统计学意义。

表1 miR-1225-5p 及CDC14B 表达与临床病理特征的关系

2.3 miR-1225-5p 及CDC14B 与喉鳞癌患者预后的关系 见图2。根据入组患者miR-1225-5p mRNA表达平均数分为miR-1225-5p 高表达组（n=18）和低表达组（n=49）。至末次随访结束，所有患者均获得完整随访资料，随访时间为4 ～60 个月，失访6 例，死亡20 例（miR-1225-5p 低表达组死亡18 例，CDC14B 阳性组19 例）。K-M 法绘制生存曲线分析预后总生存率，结果显示：miR-1225-5p 低表达组术后5年总生存率明显低于高表达组，差异有统计学意义（Log-rank P=0.046）；CDC14B阳性表达组术后5年总生存率明显低于阴性表达组，差异有统计学意义（Log-rank P=0.023）。

图2 miR-1225-5p 及CDC14B 表达与喉鳞癌患者预后的关系

3 讨论

近年在对肿瘤分子机制的研究中发现，miRNA参与基因表达的调控，与人类多种肿瘤的发生发展密切相关[9]。研究表明[10]，miRNAs 作为致癌或抑癌基因在人类多种肿瘤发病机制中发挥肿瘤抑制因子、癌基因或肿瘤干细胞调节因子等重要作用。且在miRNA 表达差异的研究中，有文献综述了近几年国内外研究癌症相关的miRNA 标记物，发现癌症的发生发展过程伴随着众多miRNAs 的异常表达，不同类型恶性肿瘤发生发展的不同阶段常伴随着某些特异性miRNA 分子表达的增高或降低[11-12]。由此可见，miRNAs 参与癌症发展的各个阶段，通过对miRNAs进行探究分析，可为喉癌临床诊治提供帮助。

miR-1225-5p 是近年新发现的一个miRNA，研究发现在胃癌及胶质母细胞瘤中miR-1225-5p 表达抑制，其异常过表达可抑制细胞的增殖、侵袭及迁移，并证实胰岛素受体底物1（nIRS1）可能是miR-1225-5p 的功能靶点，其可能通过抑制IRS1 进而发挥抑制作用[4-5]。胰腺癌细胞系中miRNA-1225-5p通过靶向JAK1 抑制胰腺癌细胞凋亡[13]。miRNA-1225-5p 通过介导ROS 生成，激活Keap1-Nrf2-HO-1 信号通路，抑制TNF-TNF -诱导的小鼠破骨细胞形成[14]。miR-1225-5p 差异表达是星形细胞瘤临床诊断及预测预后的良好标记物[15]。提示miR-1225-5p 可作为新的肿瘤治疗靶标及预后标志物。本研究探究发现喉鳞癌组织中miR-1225-5p 表达下降，进一步分析发现其与恶性病理及预后关系密切，表明miR-1225-5p 参与喉鳞癌发生发展进程。

CDC14B 是一种高度保守的双特异性磷酸酶，在肿瘤的研究中发现[16]，CDC14B 作为重要细胞周期调节因子，能够帮助DNA 修复损伤，保证基因遗传稳定性，也可抑制癌基因异常表达，防止细胞恶性病变。CHIESA 等[17]发现，在鼠成纤维细胞系NIH3T3 中CDC14B 过表达可导致细胞发生恶性转变。WEI 等[18]研究发现，CDC14B 以和癌基因H-RasV12 相似的作用方式发挥致癌作用。神经胶质瘤中，CDC14B 通过调控SKP2/p21/p27 信号通路抑制癌细胞的增殖和分化[19]。肾透明细胞癌组织中CDC14B mRNA 表达水平明显降低，其低表达患者肿瘤分期和复发风险更高[20]。恶性程度越高、侵袭性越强的不同类型甲状腺髓样癌组织中CDC14B 表达水平越低[21]。乳腺癌组织中CDC14B表达水平均较正常组织明显降低，其低表达患者肿瘤恶性程度越高，预后越差[7]。大量研究已证实[16,18]，CDC14B 涉及肿瘤发生发展的多个方面，具有多种生物学功能，既充当致癌基因，又可充当抑癌基因。而本研究检测发现，喉鳞癌组织中CDC14B 蛋白随着喉鳞癌恶性发展明显增加，提示其在喉鳞癌中可能充当致癌因子。本研究结果提示miR-1225-5p 和CDC14B 与喉鳞癌恶性发展进程及预后关系密切，为喉鳞癌的研究提供了新的思路和目标，但将其作为理想的预后分子标志物仍需纳入更多临床数据进行探讨。此外，目前有关miR-1225-5p 和CDC14B在喉鳞癌中的研究报道较少，而本研究仅基于临床病理初步探究了两者在喉鳞癌中的表达及作用，其具体调控的作用机制及两者间的相互作用还尚未知，后期还需通过设计体外实验于分子细胞生物学角度对两者参与调控喉鳞癌发生发展的内在分子作用机制进行深入探讨，以期为喉鳞癌临床治疗提供新的可靠靶点。

综上所述，喉鳞癌组织中miR-1225-5p 低表达，CDC14B 阳性表达，与临床病理及预后关系密切，进一步探究其与喉鳞癌发生发展的分子作用机制，可为喉鳞癌提供新的治疗靶点。