儿童哮喘患者外周血ILC2细胞和Th2型细胞相关因子水平变化及与临床相关性研究

李晓刚，邓巧妮，王军焕，葛君俐，康 茹

（1.宝鸡高新人民医院a.儿科；b.检验科，陕西宝鸡 721000；2.西北妇女儿童医院检验科，西安 710061）

支气管哮喘是由多种炎性细胞及细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病，伴有气道高反应性、黏液分泌增多及可逆性气流受限，晚期还可能出现气道重塑[1]。目前，哮喘发病机制尚未完全明确，但既往众多研究表明哮喘的发生发展与免疫炎症反应形成相关[2]。经典的免疫学说认为，哮喘是以Th2 型免疫反应为主的气道炎症疾病，Th1/Th2 免疫失衡是哮喘发病的重要免疫学机制，正常机体内Th0 按一定比例向Th1 和Th2 分化，两者维持相对平衡[3]。哮喘发生时，多因素作用使Th0 趋向于Th2 分化，并分泌大量2 型细胞炎性因子（如IL-4，IL-5，IL-13），启动一系列炎性反应过程，诱发哮喘的发生[4]。近年研究发现[5]，固有免疫细胞（innate lymphoid cells，ILCs）在机体炎症应答、抗感染免疫及组织重塑和修复中发挥重要作用，其不同分类中ILC2细胞能够分泌Th2 型细胞因子，与嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及自然杀伤细胞等共同参与哮喘的发生。并发现过敏性哮喘小鼠模型中，ILC2与嗜酸性粒细胞介导的炎症反应相关[6]。过敏性哮喘患者外周血、痰及肺泡灌洗液中ILC2 数量有所升高[7]。ILC2 细胞具有独立分泌Th2 型细胞因子的能力，提示ILC2 细胞可能通过产生Th2 型细胞因子进而参与了哮喘的发生发展[8]。为揭示ILC2与哮喘病情的关系，为临床诊疗提供理论参考，本研究对我院67 例急性发作期支气管哮喘患儿外周血中ILC2 细胞及Th2 型细胞因子水平进行检测分析，探究了其与哮喘患儿病情的相关性，现总结如下：

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年1月～2020年5月在宝鸡高新人民医院确诊的67 例急性发作期支气管哮喘患儿作为研究对象，根据发病严重程度分为重度-危重组23 例和轻-中度组44 例；另选取同期健康体检的45 例儿童作为对照组。哮喘组儿童年龄6～12 岁，平均年龄7.3±4.3 岁，男性38 例，女性29例；对照组儿童年龄6～14岁，平均年龄8.6±3.7岁，男性25 例，女性20 例；两组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：支气管哮喘的诊断符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中诊断标准[9]；年龄6～14 岁；无呼吸道感染病史；无全身免疫缺陷性疾病及先天性严重疾病；对照组为我院接受体检的健康儿童；本研究经我院医学伦理委员会批准，家属均知情同意。

排除标准：存在严重肝肾功能障碍；并发血液系统疾病及恶性肿瘤；支气管发育畸形或支气管异物；肺部感染者；入组前近期内应用激素等药物史、既往有哮喘家族病史、肺功能异常等。

1.2 仪器及试剂 流式抗体：Lineage，Anti-human CD45 APC，Anti-human CD127 PE-Cyanine7，Anti-Human CRTH2 PE 购自美国Thermo Fisher Scientific公司；ELISA 试剂盒购自江苏科特生物科技有限公司；DG5033A 酶标仪购自北京普朗医用设备有限公司；Master Screen 肺功能仪购自德国JAEGER 公司。

1.3 方法

1.3.1 血清样本采集：于入院后次日清晨采集两组儿童空腹外周静脉血5 ml，其中3 ml 置入EDTA抗凝管，采用Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单核细胞PBMC，转移至EP 管，-20 ℃低温保存；另外2 ml 静脉血2 000 r/min 离心10 min，留取血清，-20 ℃保存待检。

1.3.2 外周血 ILC2 细胞检测：分离的外周血PBMC 细胞，PBS 洗涤，2 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入PBS 调整细胞浓度至1×103个/ml，加入FCR 阻断剂孵育20 min，加入流式抗体，4 ℃孵育30 min，PBS 洗涤，离心弃上清，PBS 重悬细胞沉淀，采用流式细胞术检测ILC2，以外周血标本中出现Lin-CD45+CD127+CRTH2+淋巴细胞群定义为ILC2 细胞。

1.3.3 外周血Th2 型细胞因子水平检测：取静脉血离心后上层血清，采用ELISA 法按检测试剂盒说明书行血清Th2 型相关细胞因子IL-4，IL-5，IL-10，IL-13 水平检测，使用DG5033A 酶标仪于波长450 nm 处检测A 值，取其平均值作为相对含量。

1.3.4 肺功能指标检测：采用Master Screen 肺功能仪检测入组支气管哮喘患儿及正常儿童第一秒用力呼气量（forced expiratory volume in 1s，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）及最大呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF），评估其肺功能。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计数资料采用n（%）表示，组间采用χ2检验。计量资料符合正态分布的采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验；不服从正态分布以中位数和四分位数表示，采用Mann-Whitney U 检验。相关性分析采用Pearson 线性相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血ILC2 细胞比例及Th2 型细胞因子水平比较 见表1。 与对照组相比，支气管哮喘组患儿外周血ILC2 细胞比例及IL-4，IL-5，IL-13 水平明显升高，IL-10 水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；重度-危重组支气管哮喘患儿以上指标变化较轻-中度组更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 外周血ILC2 细胞比例及Th2 型细胞因子水平比较（±s）

表1 外周血ILC2 细胞比例及Th2 型细胞因子水平比较（±s）

指标 支气管哮喘组（n=67） 对照组(n=45) F P重度-危重组(n=23) 轻-中度组(n=44) t P ILC2（%） 0.08±0.06 0.04±0.03 3.650 0.000 0.02±0.01 24.419 ＜0.001 IL-4（ng/L） 54.7±4.3 49.2±5.1 4.413 0.000 25.7±8.4 209.627 ＜0.001 IL-5（ng/L） 76.6±9.4 68.3±8.5 3.659 0.000 42.8±11.6 112.640 ＜0.001 IL-10（ng/L） 9.7±3.9 11.8±4.2 1.990 0.025 22.3±5.7 80.826 ＜0.001 IL-13（ng/L） 42.4±5.8 38.6±4.5 3.076 0.002 24.6±5.4 122.855 ＜0.001

2.2 两组肺功能指标比较 见表2。与对照组相比，支气管哮喘组患儿肺功能指标FVC，FEV1，PEF明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。重度-危重组支气管哮喘患儿肺功能指标降低较轻-中度组更显著，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 肺功能指标比较（±s）

表2 肺功能指标比较（±s）

指标 支气管哮喘组（n=67） 对照组(n=45) F P重度-危重组(n=23) 轻-中度组(n=44) t P FVC（%） 65.4±8.3 73.2±7.4 3.929 0.000 92.4±6.7 128.697 ＜0.001 FEV1（%） 59.2±4.9 69.5±5.2 7.848 0.000 90.4±5.9 298.942 ＜0.001 PEF（%） 66.1±6.7 74.5±7.9 4.343 0.000 99.7±10.8 119.982 ＜0.001

2.3 支气管哮喘组患儿外周血ILC2 及Th2 型细胞因子水平与肺功能指标的相关性 见表3。 支气管哮喘患儿外周血ILC2 细胞比例及IL-4，IL-5，IL-13 水平与FVC，FEV1，PEF 呈显著负相关关系，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；IL-10 水平与FVC，FEV1，PEF 呈显著正相关关系，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 相关性分析结果

3 讨论

支气管哮喘主要由T 淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及上皮细胞等气道炎性细胞及结构细胞和细胞组分参与形成[1-2]。Th2 型免疫学说认为，免疫功能紊乱和抗原特异性Th2 细胞过度分化介导的适应性免疫应答是哮喘发病的主要因素[3,10]。抗原进入机体被抗原提呈细胞识别并激活T 细胞（Th2 细胞），使之活化分泌IL-4，IL-5，IL-13 等细胞因子，促使B 细胞产生特异性IgE 抗体；IgE 与肥大细胞、嗜酸性粒细胞表面受体结合将其激活，促进组胺等多种活性炎性介质[11]；Th2 细胞分泌的细胞炎性因子选择性作用于肥大细胞、嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞，引起哮喘相应病理改变，共同参与了哮喘的气道炎症反应及发病。近年发现[3,5]，ILC2 细胞与哮喘慢性炎症密切相关，其不仅在固有免疫应答中发挥重要作用，且可在IL-33，胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP）、脂质递质半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes, CYSLT）等因子的刺激下分泌Th2 细胞因子，参与Th2 型免疫炎症反应，为哮喘发病机制的研究提供了新的思路。

ILCs 是新发现的一类具有淋巴细胞特征，但缺乏特异性抗原识别受体的非T、非B 细胞，主要存在于黏膜组织，其通过释放相关细胞因子或介质进而调节免疫反应，在多种过敏性与非过敏性炎症疾病中发挥重要作用[12]。ILCs 根据其产生的效应细胞因子不同分为ILC1，ILC2，ILC3 三类[3]。研究表明，上皮细胞源性细胞因子IL-25 和IL-33 可激活ILC2 使其快速分泌IL-5，IL-9，IL-13 等Th2 型细胞因子，参与过敏性炎症、抗蠕虫感染及组织修复[13]。ILC2 与Th2 细胞在表型及功能上相似，被认为是Th2 型细胞的主要来源[6]。研究表明[14]，不同致敏原刺激下，ILC2 可产生大量Th2 型细胞因子，引起嗜酸性粒细胞聚集、浸润及气道高反应性和气道炎症。过敏源刺激下气道壁细胞分泌IL-33引起ILC2 激活分泌IL-5，IL-13，参与哮喘免疫应答过程[15]。哮喘患者外周血中ILC2 比例及数量与嗜酸性粒细胞计数及IgE 呈正相关；过敏性哮喘患者外周血中ILC2 比例及数量高于非过敏性哮喘患者[16]。且发现给予IL-33 刺激时人外周血中ILC2可生成IL-13，同时在成人肺组织中也发现ILC2，证实IL-33 可激活ILC2 引起肺组织Th2 型免疫应答[17]。大量研究已证实，ILC2 在以嗜酸性粒细胞浸润为特征的过敏性哮喘发病中具有重要作用。

本研究检测显示，支气管哮喘患儿外周血中ILC2 细胞比例及Th2 型细胞因子水平较正常儿童表达异常，与哮喘严重程度密切相关（P＜0.05）。这是由于损伤的气道上皮细胞分泌的IL-33 等内源性炎性介质，诱导ILC2 细胞大量增殖，引起IL-4，IL-5，IL-13 等大量分泌。此外，嗜酸性粒细胞在气道壁聚集分泌大量炎性因子是支气管哮喘的重要标准，其介导的Th2 细胞活化及炎症浸润是支气管哮喘气道高反应性及气道炎症的病理基础[18]。IL-4 与其受体表达可促进抗原激发造成嗜酸性粒细胞聚集，形成气道高反应性，引起气道黏液过度分泌；IL-5 通过调节嗜酸性粒细胞的生长、分化及活性，趋化其向气道转移，参与哮喘气道炎症反应；IL-13 则通过诱导多种细胞因子表达促进肺部大量嗜酸性粒细胞浸润，且能与炎性因子协同作用，引起哮喘气道炎症的发生及肺气肿和肺上皮细胞的黏液化生，加重支气管哮喘病理过程[19-20]。同时IL-10 作为多功能抑制性细胞因子，其表达下降，导致T 淋巴细胞应答水平显著上升，促使呼吸道高气道反应性发生改变[21]。经对比两组肺功能发现，支气管哮喘患儿肺功能指标较正常儿童显著降低，重度-危重组患儿肺功能指标降低更显著（P＜0.05） 。相关分析显示，支气管哮喘患儿外周血ILC2 细胞比例及Th2 型细胞因子水平与其肺功能指标具有显著相关性（P＜0.01），进一步提示ILC2 细胞及Th2 型细胞因子表达与哮喘患儿病情严重程度及肺功能显著相关，可能由于ILC2 细胞分泌的Th2 型细胞因子的异常改变影响了炎症反应、呼吸道重塑及平滑肌的增殖，进而影响肺功能发生变化，提示外周血ILC2 细胞及Th2 型细胞因子参与哮喘发病过程且扮演重要角色。目前针对ILC2 的研究提示其参与哮喘气道炎症调控，有望成为哮喘治疗的新靶点，而靶向ILC2 活化前后进行的一系列新的治疗方法的尝试为哮喘治疗提供了新的希望[22]。然而ILC2 调控哮喘的具体作用机制尚未完全明了，其在不同表型哮喘中的作用差异也尚不明确，还需更深入的研究以完善其在哮喘中的作用机制。此外，国内外开展的有关ILCs 的一系列相关研究使人们更好更全面地认识了免疫反应在哮喘发病中的重要作用，为研究哮喘发病机制及临床治疗提供了新的方向及路径[23]。但目前基于ILCs 在哮喘发病中的机制研究有限，其各种亚型在哮喘发病中是否存在相互抑制或协同活化作用，其在机体内具体发挥怎样的作用还有待进一步探索。因此，深入探究ILC2 在哮喘中的作用机制，进一步探究其与适应性免疫细胞间的相互关系，明确ILCs 的作用，开发更多ILCs 通路相关分子抑制药物或拮抗剂，阻断ILCs 的活化作用，可为哮喘临床治疗提供新的策略。

综上所述，急性发作期支气管哮喘患儿外周血清中ILC2 细胞比例及其相关的Th2 型细胞因子水平明显增高或降低，且与哮喘患儿肺功能具有显著线性相关性，对其进行检测有助于评估支气管哮喘患儿病情程度，可为临床治疗提供理论参考。