急性冠状动脉综合征（ACS）患者血清miR-186-5p，miR-23和miR-652水平检测的临床意义

赵 莉，白延平，谢园媛（延安大学附属医院，陕西延安 716000）

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)，是中老年常见的后天性心脏病，其发病率在各类心脏疾病中居首位[1]。急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)是IHD 的主要表现形式，是非常严重的医学急症，主要是由冠状动脉粥样硬化斑块不稳定所导致的心肌缺血，其临床表现包括急性心肌梗死(acute myocardium infarction，AMI)和不稳定心绞痛(unstable angina pectoris, UAP)。ACS 的诊断目前主要基于临床症状、心电图或侵入性血管造影。然而，这些检测易受临床主观性影响，而且血管造影有可能产生一些并发症。血肌钙蛋白I （cardiac troponin I, cTnI）为心肌损伤坏死标记物[2]，常被用于ACS 的检测，但是cTnI 在早期阶段丰度较低、特异性差。因此，急需寻找新的生物标志物来诊断ACS。

微小RNAs(miRNAs)是一种小的(18～24 个核苷酸)非编码RNA 分子，在机体内调控相关基因表达，参与各种生理过程的发展[3]。miRNAs 存在于多种生物液体中，如血清、尿液和唾液等，检测手段简单，并能够显示出器官特异性 (如肝脏中的miR-122 和心脏中的miR-499)[4]。目前已有多项研究证实miRNAs 在ACS 诊断中具有重要作用[5]。比如，miR-186-5p 在诊断ACS 方面具有良好的性能[6]；miR-23b 是ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）早期的生物标志物[7]；miR-652 的ACS 预后价值优于左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和氨基脑钠肽前体（N-terminal-pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）[8]。基于这些发现，本文评估了miR-186-5p，miR-23b, miR-652联合使用在ACS 患者中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016～2018年在延安大学附属医院收治并确诊为ACS 的患者68 例，另外选取同期做冠脉造影符合冠心病诊断，但排除ACS 的患者68 例作为对照组。所有ACS 患者均首次接受经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）。纳入标准：符合欧洲心脏病协会（ESC）和美国心脏病学会（ACC）制定的诊断标准，并经冠状动脉造影检查确诊。排除标准：有冠状动脉旁路移植术史、心源性休克、卒中、恶性疾病及各种急慢性感染性疾病的患者。根据上述诊断将ACS 分为2 个亚组：急性心肌梗死（AMI）组（n=52）和不稳定性心绞痛（UAP）组 (n=16)；平均年龄59.25±11.22 岁；男性38 例，女性30 例。对照组平均年龄为58.34±9.32 岁；男性35 例，女性33 例。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本项研究得到延安大学附属医院伦理委员会的批准（批准文号：2015-YAFVD-017），患者及家属均知情同意。

1.2 仪器与试剂 ADVIA CENTAUR XP 全自动化学发光免疫分析仪检测cTnI 水平；RNA 提取和qRT-PCR 试剂盒用于检测miRNAs 水平。

1.3 方法

1.3.1 检测外周血中的cTnI 水平：收集ACS 患者入院时(PCI 术前)及PCI 术后7 天时的外周静脉血5 ml。同时外收集对照组血样，所有样品立即以3 000 r/min 离心5 min ；取上清置于-80 ℃保存待测。实验步骤按照说明书进行。

1.3.2 PCI 治疗：由两名或两名以上经验丰富的医生根据标准指南进行PCI 介入治疗。当梗死相关动脉狭窄度≥70%时置入支架，同时由手术人员对病变动脉的类型、数量和狭窄程度进行视觉采集。经皮冠状动脉介入治疗后，残余狭窄≤20%，心肌梗死相关动脉中至少有两处出现溶栓血流分级。在进行导管插入术前，患者口服300 mg 阿司匹林（拜阿司匹林）、600 mg 氯吡格雷（波立维）、20 mg 阿托伐他汀钙片，并在PCI 过程中静脉注射50～100 IU/kg 肝素。

1.3.3 RNA 提取和qRT-PCR：采用miRNA 提取试剂盒提取总RNA，然后利用Nanodrop 评估RNA的质量。取5 ng 总RNA，采用TaqMan microRNA逆转录试剂盒合成cDNA，采用miRNA-specific TaqMan MiRNA 检测试剂盒用于测定miRNAs 的含量，以U6 作为内参。反应条件：预变性95℃，3 min；变性 95℃，30 s，退火58℃，20 s, 延伸72℃，20s，30 个循环。每个样本设置三个复孔。每组实验独立重复三次。miR-186-5p，miR-23b，miR-652 相对表达水平用2-△Ct法表示，其中△Ct=（Ct目的miRNA-Ct内参U6）。miR-186-5p 引物：CAAAGAATTCTCCTTT；miR-23b 引物：ATCACATTGCCAG；miR-652 引物：ATCACATTCAACCCTAGGAGAGGG。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0进行统计学分析。数据以M (P25, P75)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U 检验，三组间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用Spearman 分析miRNA 水平与cTnI 之间的相关性。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC) 评估诊断价值。曲线下面积（area under cure，AUC）比较采用Z 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652水平比较 见表1。AMI 患者血清中miR-186-5p，miR-23b 水平均显著高于对照组（Z=6.451，5.087, 均P=0.000）；UAP患者血清中miR-23b 水平显著高于对照组（Z=4.995，P=0.000）。AMI 患者血清中miR-652 水平显著高于对照组（Z=5.436, P=0.000）；UAP 患者血清中miR-652水平显著高于对照组（Z=3.312，P=0.001），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 血清miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平比较[M(P25,P75)]

2.2 不同病变支数患者血清中miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平比较 见表2。不同病变支数的ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平比较不全相同，差异有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较，三支、双支病变数的ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b ，miR-652 水平均高于单支，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 不同病变支数患者血清中miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平比较[M(P25,P75)]

2.3 PCI 术前及术后miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平比较 见表3。与术前比较，术后ACS 患者血清中miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平均显著下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 PCI 术前及术后 miR-186-5p, miR-23b, miR-652 水平比较[M(P25,P75)]

2.4 miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平与cTnI的相关性 见表4。进一步通过Spearman 分析ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652水平分别与cTnI 水平的相关性，结果显示miR-186-5p，miR-23b，miR-652 与cTnI 呈显著正相关（r=0.689，0.779，0.746，均P=0.000）。

表 4 miR-186-5p，miR-23b，miR-652 与cTnI 相关性

2.5 miR-186-5p，miR-23b，miR-652 对ACS患者的诊断价值 见表5。绘制ROC 受试者工作曲线，并计算AUC。通过计算最大Youden 指数确定最佳诊断临界值。miR-186-5p 临界值为0.110 时，AUC 为0.775，灵敏度为61.8%，特异度为91.2%；miR-23b 临界值为0.133，AUC 为0.799，灵敏度为69.1%，特异度为88.2%；miR-652 临界值为0.164，AUC·为0.789，灵敏度为67.6%，特异度为91.2%。三者联用AUC 为0.941，灵敏度为91.2%，特异度为83.8%。cTnI 的AUC为0.857，灵敏度为76.5%，特异度为79.4%。miRNAs 联 合AUC显著高于cTnI（Z=2.243,P＜0.05）。见图1。

表5 各项指标单独及联合使用对ACS 患者的诊断价值

3 讨论

ACS 是一种由动脉阻塞引起的心血管疾病，死亡率高、预后差[9]。目前ACS 的诊断主要取决于临床表现和cTnI 的变化，但cTnI 在ACS 早期敏感度低且特异度差[10-12]，因此寻找更高灵敏度和特异度的标记物对ACS 诊断具有重要意义。

ACS 发生过程中会出现多种生理和病理变化，包括内皮功能障碍、斑块破裂、血小板聚集、冠状动脉血栓形成、心肌缺血、再灌注损伤等[13]。miRNAs 因其独特的表达模式、较高的稳定性，正被开发用于心血管疾病的诊断或预后[14]。miR-186-5p 作为其中之一，已被证实在ACS 患者中呈高表达，其高表达后能促进动脉粥样硬化脂质的积累，增加巨噬细胞中促炎细胞因子分泌，从而加速动脉粥样硬化病变，最终导致ACS 的发生[15-16]。另一项研究发现miR-23b 在心力衰竭细胞中呈过表达，通过抑制缺氧下细胞的生长速度来促进心肌细胞凋亡[17]。当发生急性心肌组织损伤时，miR-652 在巨噬细胞中呈现高表达，会诱导产生大量炎症因子，而炎症因子会进一步促进巨噬细胞的增殖、分化，从而加速斑块损伤，导致ACS 发生[18-19]。基于此，本文检测了非ACS 患者和ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平，发现ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平显著升高，这与之前的研究结果一致[6-8]。进一步发现三支、双支病变数患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平均高于单支。表明miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平与ACS 患者病情严重程度密切相关。分析对比PCI 术前、术后ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平变化，结果显示术后miRNAs 水平显著降低。因此，miRNAs 水平变化可以用于观察ACS 患者再灌注治疗后的病情进展情况。

早期研究发现miR-186-5p 联合脂质参数与炎症指数在ACS诊断中具有优良的性能（AUC为0.94）[6]。miR-23b（AUC 为0.809）在AMI 的诊断上能力优于传统CK-MB（AUC为0.753）和cTnI (AUC为0.783)[7]。miR-652 水平在ACS 急性期显著升高，与ACS 的预后相关[8]。本文分析发现，miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平与cTnI 呈显著正相关，推测miR-186-5p，miR-23b，miR-652 可能与cTnI 具有相似的ACS诊断能力。进一步绘制ROC 曲线，结果表明miR-186-5p，miR-23b 联合miR-652 (AUC 为0.941)诊断能力优于cTnI (AUC 为0.857)，且灵敏度（91.2% vs 83.8%）和特异度（76.5% vs 79.4%）高于cTnI。

总之，本文证实了miR-186-5p，miR-23b，miR-652 联合使用诊断ACS 优于cTnI，为ACS 的诊断提供临床参考价值。