基于网络药理学探讨五苓散治疗糖尿病肾病的作用机制

詹立北

摘要 目的：根据网络药理学方法对五苓散治疗糖尿病肾病（DKD）的作用机制进行研究探讨。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对五苓散中有效成分进行筛选及靶点预测，检索GeneCards、CTD数据库筛选DKD疾病靶点，利用韦恩图在线平台筛选五苓散治疗DKD交集靶点，借助网络拓扑分析插件CytoNCA筛选五苓散治疗DKD核心靶点，使用Cytoscape 3.7.1建立化合物-疾病-靶点调控网络，基于DAVID数据库对核心靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果：基于TCMSP得到五苓散的27个有效成分和62个潜在靶点，筛选获得与DKD疾病发生、发展相关的靶点21 153个，借助网络拓扑分析插件CytoNCA筛选五苓散治疗DKD核心靶点16个，GO功能富集分析得到条目99个，其中生物过程条目64个、分子功能条目24个、细胞组成条目11个，主要包括过脂质反应、G蛋白偶联受体信号途径、肾上腺素能受体活性、四吡咯结合、胞膜小凹等功能途径;KEGG通路富集分析得出条目61个，主要包括NF-κB信号通路、细胞凋亡、TNF信号通路、雌激素信号途径、IL-17信号通路等通路途径。结论：基于网络药理学初步探讨并验证了五苓散治疗DKD多成分、多靶点、多通路的整体调节作用特点，预测了五苓散治疗DKD的潜在作用机制，以期为其活性成分研究与实验研究提供科学依据。

关键词 网络药理学;五苓散;糖尿病肾病;信号通路;靶点

Abstract Objective：To explore the mechanism of Wuling Powder（WLP）in treatment of diabetic kidney disease（DKD）based on network pharmacology.Methods：Using TCMSP to screen effective components and targets of WLP，searching GeneCards，CTD to screen targets of DKD，constructing Venn online platform to get intersection targets of WLP-DKD，selecting common targets of WLP-DKD by using CytoNCA，using Cytoscape 3.7.1 to build component-disease-target network，analyzing GO function enrichment and KEGG pathway enrichmen by David database.Results：27 effective components and 62 potential targets of WLP were obtained based on TCMSP，21 153 targets related to the occurrence and development of DKD were obtained，16 common targets of WLP-DKD were obtained by using CytoNCA.99 items were obtained by GO function enrichment analysis，including 64 biological process items，24 molecular function items and 11 cellular component items，mainly including response to lipid，G protein-coupled receptor signaling pathway，adrenergic receptor activity，tetrapyrrole binding，caveola.KEGG pathway enrichment analysis obtained 61 items，including TNF signaling pathway，IL-17 signaling pathway，NF-κB signaling pathway，apoptosis and estrogen signaling pathway signaling pathway.Conclusion：Based on network pharmacology，the overall regulatory characteristics of WLP in treatment of DKD were discussed and verified，and the potential mechanism of WLP in treatment of DKD was predicted，in order to provide scientific basis for the study of active ingredients and experimental research.

Keywords Network pharmacology; Wuling Powder; Diabetic kidney disease; Signaling pathway; Target

中圖分类号：R285;R256.5;R255.4;G350.7 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.004

糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病病程进展过程中最主要的慢性高血糖所致肾脏损害并发症，也是发达国家肾脏衰竭及终末期肾脏透析的首要病因[1]。据统计，20% ～30%糖尿病患者将会发展为DKD，严重危害糖尿病患者的预后及生命质量[2]。DKD发病机制极为复杂，迄今尚未完全阐明，包括肾小球超滤、细胞外基质沉积、多元醇通路激活、蛋白激酶C活化、氧化应激、遗传因素等多种因素综合作用所致[3]。目前临床DKD的治疗主要集中于纠正糖脂代谢紊乱、控制血压、运动营养干预及降低尿蛋白等方面[4]，临床治疗上仍未取得满意疗效。因此，探析DKD发病机制寻求有效靶点早期干预以延缓DKD疾病进展具有重要意义。而在整体观念、辨证论治等思想指导下，中药复方具有多靶点、多层次的治疗特点，在DKD防治方面具有独特优势及巨大潜力。目前针对五苓散治疗DKD研究多为临床病例观察或针对个别活性单体进行，并不能较为全面地反映五苓散治疗DKD的潜在药理作用机制。网络药理学则为从系统药理学、系统生物学层面阐述五苓散治疗DKD的潜在作用机制提供了理论依据，为治疗DKD多靶点新药创制研发与药理作用机制研究提供了技术支撑[5]。基于网络药理学对中药复方的有效成分-活性靶点-疾病靶点进行综合网络构建，使得中药药理学特征概括更为全面，同时也符合中药复方多成分、多靶点、多途径的作用特点[6]。本研究基于网络药理学对五苓散治疗DKD的有效成分、活性靶点、潜在机制进行探讨，以期为药理作用研究和临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及分析平台 本研究所使用的数据库及分析平台详见表1。

1.2 五苓散中有效成分筛选及靶点预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）对五苓散中茯苓、猪苓、泽泻、桂枝、白术的有效成分进行初步筛选，其中筛选条件为类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，并对筛选有效成分进行靶点预测，利用UniProt将筛选靶蛋白名进行标准化。

1.3 DKD疾病靶点的获取 以“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”作为关键词，检索并筛选GeneCards、CTD数据库获取DKD疾病靶点。

1.4 核心靶点筛选及蛋白相互作用网络构建 将五苓散治疗DKD靶点进行映射，利用韦恩图在线平台筛选交集靶点。利用STRING数据库在线平台构建五苓散治疗DKD交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络，筛选条件设置：种属选择人、互作分数值为0.4。借助网络拓扑分析插件CytoNCA，根据DC、BC、CC、EC、NC、LAC等参数进行拓扑，筛选各指标大于所有节点中位数的节点即为核心靶点。

1.5 核心靶点的GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 将筛选后的核心靶点上传至Cytoscape 3.7.1建立化合物-疾病-靶点调控网络，以展现五苓散在系统水平上对DKD的作用关系。利用DAVID数据库显示五苓散治疗DKD的核心靶点蛋白在基因功能中的作用，并对五苓散治疗DKD核心靶点进行基因本体（GO）功能富集分析与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，物种限定为人类，阈值设定为PValue<0.05，利用OmicShare云平台将数据结果可视化，富集分析结果采用柱状图和气泡图形式展现。其中，不同颜色节点代表不同类型富集结果，而其大小与显著程度呈正相关。

2 结果

2.1 五苓散中有效成分筛选和靶标预测结果 根据DL、OB参数对TCMSP进行筛选，共得到五苓散中茯苓、猪苓、泽泻、白术、桂枝的有效成分46个，其中有19个有效成分未预测到对应靶点，最终获得有效成分27个，有效成分对应的靶标62个，结果见表2。

2.2 DKD疾病靶点筛选结果 通过检索GeneCards、CTD数据库，检出与DKD相关的靶点分别为10 661个、18 750个，删除检索结果中重复靶点后共纳入21 153个与DKD发生发展相关的靶点。

2.3 核心靶点筛选及PPI网络构建结果 利用韦恩图在线平台将21 153个DKD疾病靶点与62个五苓散有效成分作用靶点映射以绘制韦恩图，即五苓散治疗DKD的交集靶点，结果见图1，其中蓝色代表GeneCards疾病靶点，黄色代表CTD疾病靶点，绿色代表五苓散有效成分作用靶点，由此可筛选得到五苓散治疗DKD交集靶点60个。在STRING数据库在线平台输入60个交集靶点，利用网络拓扑分析插件CytoNCA，限定参数（DC≥8，BC≥20，CC≥0.239，EC≥0.09，NC≥5.65，LAC≥3.75）拓扑筛选后获得16个核心靶点，再次导入STRING数據库在线平台构建PPI网络图，结果见图2。五苓散治疗DKD的核心靶点条形图可筛选出核心靶点，即邻接节点数目越多表示成为核心靶点的概率越大，结果见图3。在PPI网络图中，共有16个节点，63条边，网络节点代表靶点蛋白，线条代表靶点蛋白之间的联系，线条越多表示关联程度越大。最终筛选得到五苓散治疗DKD核心靶点16个，分别为ACHE，ADRA1A，ADRA1B，AR，CASP3，CAT，CHRM1，ESR1，F2，ICAM1，JUN，NOS3，NR3C1，PTGS2，RELA，SLC6A4。

2.4 化合物-疾病-靶点调控网络构建结果 利用Cytoscape 3.7.1将16个核心靶点、14个有效成分、中药（茯苓、猪苓、泽泻、白术、桂枝）和疾病（DKD）导入以构建化合物-疾病-靶点调控网络，结果见图4。网络中共包含30个节点（16个核心靶点节点以及14个有效成分节点）以及33条边，其中绿色长方形节点代表有效成分，紫色椭圆形节点代表靶点。在有效成分方面，MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000049（3β-乙酰氧基苍术酮）作用靶点均为7个，MOL004576（二氢槲皮素）作用靶点为4个。在核心靶点方面，7个核心靶点能与≥2个有效成分相连接，其中PTGS2能与9个有效成分相连接，NR3C1能与4个有效成分相连接。由此可见，网络中存在一个有效成分与多个核心靶点的相互作用，同时也存在不同有效成分相互作用于同一核心靶点，体现了中药多成分、多靶点治疗DKD的作用机制。

2.5 GO功能富集分析结果 利用DAVID 6.8对16个核心靶点进行GO功能富集分析，共得到GO条目99个，其中功能（Molecular Function，MF）条目24个、细胞组成（Cellular Component，CC）条目11个、分子生物过程（Biological Process，BP）条目64个，主要富集结果见图5，各自GO功能富集分析结果见图6～8。GO功能富集分析结果显示：BP主要涉及有细胞增殖、脂质反应、血管直径及容量调节、血管收缩、有机环状化合物及含氧化合物反应、G蛋白偶联受体信号途径等方面;MF主要涉及蛋白质同源二聚化及异源二聚化活性，肾上腺素能受体活性、RNA聚合酶II转录因子结合、四吡咯结合等方面;CC主要涉及等膜筏、膜微域、胞膜小凹、突触前后膜等方面。

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（2020-01-09收稿 责任编辑：苍宁）