基于网络药理学知母不瓢匾┒灾瘟铺悄虿∽饔没制

赵灿 杨金伟 吴勇军

摘要 目的：探讨知母-黄柏药对治疗糖尿病（DM）的作用机制。方法：通过TCMSP、化学专业数据库检索知母、黄柏化学成分和作用靶点，并在UniProt数据库中进行靶点与基因转换，通过OMIM、Drugbank数据库查询现有DM相关基因。进而运用Cytoscape 3.7.1构建成分-靶点网络、靶点相互作用（PPI）网络并进行网络拓扑分析，最后通过Omicshare进行基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，研究其作用机制。结果：成分-靶点网络共有127个化合物和107个靶点，其中关键化合物涉及槲皮素、豆甾醇、山柰酚等。PPI网络包含107个蛋白，其中关键靶蛋白涉及INS、AKT1、IL6、VEGFA、TNF等。GO功能富集分析得到2 612个条目（P<0.05），其中生物过程（BP）条目2 125个，分子功能（CC）条目138个，细胞组成（MF）条目349个。KEGG通路富集分析筛选到157个信号通路（P<0.05），涉及到MAPK信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗等信号通路。结论：知母-黄柏中的主要治疗糖尿病活性成分是槲皮素、豆甾醇、山柰酚，靶点主要涉及INS、AKT1、IL6、VEGFA、TNF等，通过MAPK信号通路、AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗等信号通路协同治疗DM。

关键词 知母;黄柏;糖尿病;网络药理学;靶点;基因;信号通路

Abstract Objective：To investigate the mechanism of diabetes mellitus（DM）treatment by drug pair containing Rhizoma Anemarrhenae and Cortex Phellodendri.Methods：The chemical constituents and targets of Rhizoma Anemarrhenae and Cortex Phellodendri was searched through TCMSP and chemical professional databases，and target and gene conversion were performed in the UniProt database，and existing DM related genes were checked through OMIM and Drugbank databases.Then Cytoscape 3.7.1 was used to construct a component-target network，a target interaction（PPI）network and perform network topology analysis.Finally，Omicshare was used to perform gene GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis to study its mechanism of action.Results：The compound-target network contained 127 compounds and 107 targets，and key compounds involved quercetin，stigmasterol，kaempferol，etc.The PPI network contained 107 proteins，and key target proteins involved in INS，AKT1，IL6，VEGFA，TNF，etc.The functional enrichment analysis of GO obtained 2 612 items（P<0.05），of which there were 2 125 biological process（BP）items，138 molecular function（CC）items，and 349 cell composition（MF）items.There were 157 signaling pathways（P<0.05），involving MAPK signaling pathway，fluid shear stress and atherosclerosis，AGE-RAGE signaling pathway，and insulin resistance and other signal pathways.Conclusion：The main therapeutic active compound of diabetes in Rhizoma Anemarrhenae and Cortex Phellodendri are quercetin，stigmasterol and kaempferol.The targets mainly involve INS，AKT1，IL6，VEGFA，TNF，etc.Through the MAPK signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway，insulin resistance and other signaling pathways，DM is co treated.s

Keywords Rhizoma Anemarrhenae; Cortex Phellodendri; Diabetes; Network pharmacology; Target; Gene; Signal pathway

中圖分类号：R285;R255.4;G350.7;R282.71 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.002

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一组由多病因引起以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和（或）利用缺陷所引起[1]。属于中医学“消渴”范畴，病机为阴液亏损，燥热偏胜，而以阴虚为本、燥热为标[2]。目前西医主要采用饮食控制、运动锻炼、口服传统降糖药物、注射胰岛素等手段进行治疗，但不良反应多，且难以控制病情的发展。与西医相比传统中医药在整体观的基础上，通过辨证论处方，综合调理机体阴阳失衡状态，标本兼顾缓急有序，对DM治疗和缓解有一定的优势。

知母、黄柏是一种常用的经典药对，最早出自金·李杲的《兰室秘藏·卷下·小便淋闭门》，方名通关丸，亦名滋肾丸[3]。其中知母为百合科植物知母的干燥根茎，性寒，味苦、甘，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、生津润燥的功能，现代研究表明知母提取物具有降低空腹血糖和提高胰岛Β细胞数量[4]。黄柏为芸香科植物黄皮树的内皮，性寒，味苦，归肾、膀胱经，具有清热燥湿，泻火除蒸，解疗疮之功效，现在药理学研究揭示黄柏有效成分具有降糖功效[5]。知母黄柏药配伍在很多方剂中有所体现，如知柏地黄丸、滋肾通关丸等。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点（nodes）进行多靶点药物分子设计的新学科[6]。网络药理学具有多成分、多靶点、多途径的特点，其整体性、系统性与中药复方多多成分、多途径、多靶点的分析角度类同，本研究运用网络药理学分析知母-黄柏药对DM病的干预的机制。从细胞分子水平为其机制试提供参考。

1 资料与方法

1.1 知母、黄柏化学成分与相关靶点获取 通过TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、（Chemistery Database）化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）及结合相关文献确定知母、黄柏化学成分。将获取的化学成分在TCMSP数据库查询其相关靶点，同时结合Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org），并限制为“homo sapiens”进行靶点-基因的转换，最终获得知母、黄柏的基因靶点。

1.2 DM已知作用靶点获取 通过2个数据库获取DM已知治疗靶点，一个是Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca/drugs），使用关键词“Diabetes mellitus”仅选择经食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗DM药物的靶点。另一个是在线孟德尔遗传OMIM数据库（https：//www.omim.org），通过主题词“Diabetes mellitus”进行检索DM相关靶点，2个数据库查询结果进行合并，删除重复靶点。将获得的DM靶点与知母、黄柏预测的作靶点进行比对，筛选共同靶点，并通过Wenny2.1.0在线软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作韦恩图。

1.3 网络模型的构建及分析 将知母、黄柏和DM共有靶点导入STRING 11.0数据库（https：//string-db.org/）中进行检索，选取minimum required interaction score>0.4的靶点，构建靶点相互作用（PPI）网络，下载tsv文件，经整体后所得数据导入Cytoscape3.7.1软件制作靶点相互作用网络，并对进行网络分析以设置节点大小和颜色反映Degree的大小、边的粗细反映Combine score的大小。将上述的知母、黄柏治疗DM潜在靶点数据进行整体后导入Cytoscape制作知母、黄柏成分-靶点网络。运用软件中的Network Analyzer插件对上述2个网络进行拓扑分析，以Degree和betweenness centrality这2个参数作为重要考量。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 上述所得的靶点在HGNC数据库（https：//www.genenames.org/）中进行ID转换，即将知母黄柏与DM的共作靶点转换成Gene stable ID，获取的结果输入Omicshare在线软件（https：//www.omicshare.com/）进行分析，得到GO和KEGG富集分析的二级分类柱状图、气泡图及包含P值的结果。

2 结果

2.1 药物化学成分数据库与靶点预测 通过TCMSP数据库和Chemistery Database数据库，剔除3个重复活性成分总共检索到272个化学成分，其中知母171个，黄柏104个。将上述的化学成分输入TCMSP数据库中获取其靶点，并结合Uniprot数据库共获得283个靶点，其中知母137个，黄柏267个，两药重复267个。在Drugbank和OMIM数据库中检索DM全部相关靶点，并与知母、黄柏预测靶点进行比对，其中知母、黄柏两药共有107个潜在靶点与治疗DM相关。见表1。

2.2 知母、黄柏与T2DM的交集基因 通过在线韦恩图得出知母、黄柏与DM共有基因107个，知母与DM的共有基因63个：黄柏与DM的共有基因101个。即知母-黄柏药对潜在作用靶点与DM相关靶点共有107个交集基因，其中知母63个占知母预测总靶点的46.0%，黄柏101个占黄柏预测总靶点的37.9%。见图1。

2.3 网络可视化 将上述知母、黃柏与DM共有靶点导入string11.0中构建靶点相互作用（PPI）网络，见图2，总共107个节点，1 378条边，平均节点数为25.8，占总节点数的55.1%。图中节点的大小和颜色表示Degree值的大小，节点越大、颜色由绿变红对应的Degree值越大。边的粗细表示Combine score，边越粗Combine score值越大。知母、黄柏成分-靶点网络见图3，图中共有234个节点（其中127个成分，107个靶点）和706条边，红色三角形节点代表成分，蓝色圆形节点代表靶点。

2.4 网络分析 将上述知母、黄柏的潜在靶点相互作用网络和成分-靶点网络进行拓扑分析，根据连接度和介度来评价节点在网络中的重要性。在靶点相互作用网络中，度排名靠前的是INS、AKT1、IL6、VEGFA与TNF，分别能与87、75、66、62与62个化合物相互作用，其他连接度靠前的靶点见表2。在成分-靶点网络分析中，选取成分分析結果度靠前的结果。见表3。其中度排名前5的是quercetin、Stigmasterol、kaempferol、oleic acid与beta-sitosterol，分别能与61、26、25、19与16个化合物发生连接。

2.5 GO功能富集分析 将上述知母、黄柏DM共有靶点经Omicshare在线软件分析，筛选P<0.05后总共得到2 612个功能，其中最显著性相关功能条目见图4。图中蓝色代表Biological process（BP）、橘色代表Molecular Function（MF）、绿色代表Cellular Component（CC），其中BP中富集靶基因靠前的是cellular process（102个靶基因）、response to stimulus（101个靶基因）、biological regulation（99个靶基因）、regulation of biological process（97个靶基因）、multicellular organismal process（91个靶基因）;MF中富集靶基因靠前的是诱导binding（97个靶基因）、catalytic activity（44个靶基因）、molecular function regulator（33个靶基因）、molecular transducer activity（27个靶基因）、transporter activity（18个靶基因）;CC中富集靶基因靠前的是细胞cell（99个靶基因）、cell part（98个靶基因）、organelle（79个靶基因）、membrane（73个靶基因）、organelle part（70个靶基因）等。提示DM可能与这些生物学功能有关。

2.6 KEGG通路富集分析 经Omicshare软件在线KEGG通路富集分析，筛选P<0.05后，总共得到157条通路，其中显著性通路见图5、表4，图中横坐标表示靶点数，纵坐标表示通路名称，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色，其通路涉及MAPK信号通路（MAPK Signaling Pathway）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）、AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、胰岛素抵抗（Insulin Resistance）、非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease）、癌症中的Micrornas（MicroRNAs in Cancer）、Foxo信号通路（FoxO Signaling Pathway）等，这些通路反映了中药多靶点参与体内多个生物学过程，同时表明知母、黄柏可能通过这些生物过程发挥其治疗DM的作用。

3 讨论

现代药理学表明知母其化学成分主要为皂苷类、双苯吡酮类、生物碱类、氨基酸类、挥发油类等化合物，具有抗血小板血栓、改善阿尔茨海默症、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降脂、抗动脉粥样硬化、改善骨质疏松症状、抗氧化等作用，对循环系统、内分泌系统、心血管系统等疾病有一定的疗效[7-8]。黄柏的主要化学成分为黄酮类和生物碱类，此外还含有黄柏酮、黄柏内酯、白鲜交酯、黄柏酮酸、青荧光酸、7-脱氢豆甾醇、p-谷甾醇、菜油甾醇等成分，具有抗菌作用为抗菌、抗心律失常、降血压、抗消化道溃疡、收缩或舒张肠管、促进胰腺分泌、抑制细胞免疫反应、降血糖等作用，对心血管系统、消化系统、神经系统、内分泌系统等疾病具有一定的疗效[9-10]。知母-黄柏皆苦寒，两者配合使用具有清热生津润燥、泻火除蒸，属中药配伍“七情”中相须为用，其功效与消渴病阴液亏损，燥热偏胜病机相对应。

本研究通过网络药理学来揭示知母、黄柏多成分、多靶点、多途径治疗DM作用机制。通过TCMSP、Chemistery Database、Uniprot数据库查询其化学成分及靶点，Drugbank、OMIM数据库查询DM疾病靶点，经过整理后共107个DM相关基因，将结果反向推理知母、黄柏涉及DM相关化合物，总共得到127个。对其成分-靶点网络和靶点相互作用PPI网络进行分析，槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、山柰酚（Kaempferol）度属性排名前三，其中槲皮素（Quercetin），豆甾醇（Stigmasterol）属黄柏主要成分，现有研究表明槲皮素能降低2型DM大鼠的血糖，其机制可能与其降低机体氧化应激水平，抑制胰岛细胞凋亡及增强肝脏丙酮酸激酶活性有关[11]。Panda，M等[12]研究发现豆甾醇可降低小鼠血清葡萄糖浓度以及肝葡萄糖-6-磷酸酶活性（G-6-Pase），提升胰岛素水平降低血糖。山柰酚（kaempferol）属知母主要成分，现有研究表明山柰酚可通过促进骨骼肌中的葡萄糖代谢和抑制肝脏中的糖异生来发挥抗DM作用[13]。Sharma等[14]发现山柰酚可抑制NRK-52E和RPTEC细胞中高血糖诱导的RhoA活化，降低氧化应激，促炎细胞因子（TNF-α和IL-1β）和纤维化（TGF-β1）表达，来治疗DM肾病。在靶点方面，度排前的是胰岛素（INS）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1），在DM中发展过程中胰岛素不足起到决定性作用，从PPI网络分析中INS连接度最高，从中可以表明知母、黄柏可以通过胰岛素来治疗DM，许丽红等[15]研究发现Akt1是2型DM的易感基因之一。

对知母、黄柏靶点的进行KEGG通路富集中发现MAPK信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗、FoxO信号通路、内分泌抵抗、IL-17信号通路、癌症中的微小RNA等通路可能是知母、黄柏改善DM作用机制。这些通路已被相关文献及临床病例证实与治疗DM有关。作为细胞重要的通路，MAPK可以上调葡萄糖转运载体-4的表达，促进糖的吸收和利用，增加胰島素受体的敏感性，改善胰岛素抵抗[16]。大量研究表明DM与氧化应激机制有关，AGE-RAGE信号通路可调节细胞内氧化应激通路[17]。胰岛素是体内重要的降低血糖的激素，胰岛素抵抗导致体内胰岛素对葡萄糖摄取和利用的效率下降，引起血糖升高。FoxO通路介导胰岛素或胰岛素样生长因子对细胞代谢，对调控机体血糖的平衡有重要作用[18]。糖类代谢与内分泌密切相关，内分泌抵抗引起体内血糖代谢相关激素（胰岛素）缺乏，导致机体糖类失衡。IL-17通路诱导的细胞炎性反应，吕元军等[19]发现IL-17可能与DM有关。另外，本次通路富集还富集了非酒精性脂肪性肝病、南美锥虫病等疾病的多条信号通路，表明了机体内疾病之间存在相互影响。

综上所述，通过网络药理学对知母-黄柏药治疗DM的机制进行研究，在多成分、多靶点的方式上与传统靶点研究有一定的优势，但其忽略计量大小以及成分靶点筛选标准，需要课题组后期的进一步研究。

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（2019-12-25收稿 责任编辑：苍宁）