金黄色葡萄球菌生物被膜形成及检测方法研究

赵朵 肖娜 裴曼君 梁冉 张文乐 唐一通

[摘 要]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是引起医院感染的重要病原菌。金黄色葡萄球菌生物被膜是其重要的毒力因子，临床上许多感染均与生物被膜相关。了解金黄色葡萄球菌生物被膜的形成机制与检测方法，对于控制金黄色葡萄球菌生物被膜感染及耐药性的形成，制订有效的预防措施和治疗方案有着重要作用。文章对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及检测方法进行综述。

[关键词]金黄色葡萄球菌;生物被膜;检测方法

[基金项目]2016年湖北省自科基金“MRSA分子分型及临床常用消毒剂对Sccmec耐药元件水平转移影响机制研究”（2016CFB319）;2017年襄阳市科技研究与开发项目“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）快速检测方法及本地区MRSA分子流行病学和耐药性研究”（襄科计（2017）10号）;2018年湖北省大学生创新创业项目“襄阳市食品中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药性研究”（鄂教高函[2018]21号）

[作者简介]赵 朵（1998—），女，湖北襄阳人，湖北文理学院医学院临床医学本科生在读，研究方向为细菌耐药性;肖 娜（1981—），女，河南确山人，生物化学与分子生物学硕士，湖北文理学院医学院高级实验师，研究方向为细菌耐药性与分子分型;裴曼君（1998—），女，湖北随州人，湖北文理学院医学院临床医学本科生在读，研究方向为细菌耐药性;梁 冉（1998—），男，湖北襄阳人，湖北文理学院医学院临床医学本科生在读，研究方向为细菌耐药性;张文乐（1997—），女，湖北襄阳人，湖北文理学院医学院临床医学本科生在读，研究方向为细菌耐药性;唐一通（1983—），男，河南开封人，微生物学博士，湖北文理学院医学院副教授（通信作者），主要从事细菌耐药性研究。

[中图分类号] R917[文献标识码] A[文章编号] 1674-9324（2020）47-0-03[收稿日期] 2020-05-30

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是临床上常见病原菌之一，在医院感染中居第2位，仅次于由大肠埃希菌引起的感染[1]。生物被膜是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子，临床上许多感染均与生物被膜相关，包括心内膜炎、骨髓炎以及与医疗器材相关的感染，如人工关节、气管导管、血透置管、血管导管、心脏起搏器和心脏瓣膜等引起的感染。有研究表明金黄色葡萄球菌形成的生物被膜也是导致其耐药性增强的主要原因之一。因此，了解金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及感染机制，对于控制金黄色葡萄球菌生物被膜感染及耐药性的形成，制订有效的预防措施和治疗方案有着重要作用。本文对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及检测方法进行综述。

一、生物被膜的形成

生物被膜是指细菌黏附于接触表面，分泌多糖基质等胞外聚合物等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样结构化群落。生物被膜的形成过程有明显的阶段性特征，首先是细菌菌体黏附在物体表面，然后是群体的积聚和生物膜的成熟，最后在扩散阶段通过菌体的传播引起其他物体表面的污染。金黄色葡萄球菌是一种易形成细菌生物被膜的革兰氏阳性球菌[2]，与其他形成生物被膜细菌相似，其形成生物被膜过程也有黏附与积聚、成熟和扩散等阶段性特征。

（一）细菌黏附与积聚

细菌黏附于接触表面，形成单细胞层，是生物被膜形成的基本条件。在这一阶段，金黄色葡萄球菌细胞壁锚定蛋白发挥重要介导作用。多种细胞壁锚定蛋白由金黄色葡萄球菌编码，该蛋白根据结构不同可分为不同种类。其中MSCRAMM家族（Microbial Surface Components Recognizing Surface Adhesive Matrix Molecules）是重要的一类，主要包括纤连蛋白结合蛋白、聚集因子等。经过初期粘附后，细菌激活特定基因分泌大量细胞外基质包裹自身，并在其中增殖以逃避抗生素杀伤和宿主自身免疫清除作用，促使黏附更加牢固。多糖胞间黏附素（Polysaccharide Intercellular Adhesion PIA）和胞外DNA等在整个过程中发挥作用。细菌黏附有许多影响因素，如接触材料特性、細菌疏水性、细胞外部膜蛋白以及微生物生长特性等。

（二）生物被膜的成熟

随着生物被膜内细菌生长和相关多糖蛋白基质的积聚，该阶段生物被膜的结构由类似蘑菇状或堆状的微菌落组成。成熟的膜结构具有不均一特点，在微菌落周围围绕大量管道以运送养分、代谢废物等。而生物被膜内部的微菌落是高度组织的群体，细菌之间可进行群体感应的信息交流，检测群体的菌体密度，从而进行特定基因表达，维持细菌群体的生长代谢稳定，并保证营养的输入和代谢废物的排出等。在生存环境发生改变情况下，生物被膜中的细菌会通过相应机制调节生长活动以适应外部环境。

（三）细菌的播散

生物被膜在成熟阶段可以进行扩散和传播。这一过程可通过局部蔓延、部分脱落或释放浮游细菌来实现。生物被膜内脱落或释放出来的细菌变为浮游菌，再次定植于惰性材料表面，从而再次经历黏附与积聚、成熟和扩散等循环阶段。

二、生物被膜抗性

细菌在形成生物被膜后，对抗菌物质、热、酸碱度等物化环境因素的抵抗力明显增强。有研究表明，生物被膜内细菌较其浮游状态细菌对抗生素的耐药性提高10—1000倍。金黄色葡萄酒生物膜抗性主要有以下原因：

（一）屏障作用

细菌黏附聚集形成生物被膜后，在生物被膜的包裹下，可阻挡抗生素和消毒剂等渗入造成对内部细菌的损伤和破坏。生物膜外层的多糖复合物层除可阻止抑菌物质渗入外，还可与部分杀菌物质结合从而减弱或消除其对生物膜内细菌的杀伤，从而达到耐药效果。

（二）延缓细菌生长

细菌生物膜内部的营养物质浓度有着梯度变化的特点，处于表层的细菌能够较易获取营养物质和氧气，代谢较为活跃。生物被膜深层细菌由于处于营养缺乏、低氧和大量代谢废物存在的微环境中，造成其多处于休眠或亚休眠状态，代谢缓慢，甚至类似于芽孢菌的分化形式，因此具有更强的生存能力，对外部环境中的理化因素具有较强的抵抗力。

（三）密度感应系统（QS）调节

密度感应系统（QS）是指生物被膜内部细菌根据群体密度的大小利用信号分子进行信息交流，并调控特定基因的表达使群体行为协调的机制。QS系统在BF形成后，信号分子会与某些特定受体结合，激发特定基因表达，使整个菌团系统达到平衡[3]。破坏QS系统的表达对于破坏BF形成具有重要意义。

三、细菌生物被膜形成能力检测

（一）刚果红琼脂培养基法

金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中，需黏附在载体表面和分泌大量多糖基质PIA，刚果红能与PIA结合，培养超过24h，会使刚果红的颜色褪去，由红色变为黑色[4]。但是此种方法不能够区分生物被膜形成能力的强弱，是一种定性检测方法。Panda P S等等对刚果红培养方法进行了改良，对葡萄球菌生物被膜进行检测具有较好实验结果。徐子恒等利用刚果红培养基定性和结晶紫染色法定量测定了金黄色葡萄球菌生物被膜。魏莲花等采用刚果红平板法对保存的100株金黄色葡萄球菌菌株进行了筛选，并在电镜下对产生物被膜菌株进行生物膜显微结构的观察。

（二）结晶紫（CV）染色法

结晶紫能与生物被膜表面带负电荷的表面分子和多糖成分结合而使生物被膜显色，因此可以通过测定不同菌株与结晶紫结合后的吸光度值对菌株形成生物被膜的能力进行定量的检测。1985年Christensen等首次采用结晶紫染色方法对非黏液性链球菌生物被膜进行了定量分析。2000年，Stepanovic等对结晶紫方法进行改进，增加了结晶紫染色方法对细菌生物被膜定量的准确性，其能够对微孔板生物被膜生物量进行较为全面的量化。李冰等[5]利用96孔板培养和结晶紫法对58株金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力进行了定量检测，通过检测不同培养孔中的吸光度值（OD值）的大小对生物被膜形成能力分类为不粘附、弱黏附、中等黏附和强黏附。

（三）顯微镜技术

1.扫描电子显微镜。SEM可用来直接观察载体表面黏附的金黄色葡萄球菌生物被膜的形态结构和表型特征。Clauss等研究表明，SEM检测金葡菌在多孔材料表面和光滑材料表面上形成生物被膜的能力不同，所需时间也不同。Kumar D等用SEM方法进行细菌生物被膜的定量检测。SEM技术虽然分辨率高，但SEM处理样品时步骤烦琐，可能会破坏样品结构，图形缺乏垂直分辨率。同时SEM设备精密价高，不易于实验室常规检测。

Pompilio A等用环境扫描电镜（E-SEM）在高倍放大下观察含水和非导电的活细菌生物被膜，可不受人为操作产生的假象的影响。E-SEM虽然能够在自然状态下成像，但对湿样本分辨率低，并且可能引起样本损伤。聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）可用于观察生物膜内部结构，通过软件得到连续图像切片从而获得三维重建生物膜模型，但检测需要真空环境，并且离子束损坏会降低分辨率。原子力显微镜（AFM）可用于确认其他技术获得的结果，确定生物被膜的黏附力，强度，但其观察范围小，测定也会带来样本的损伤。

2.激光共聚焦扫描显微镜。激光共聚焦扫描显微镜通过荧光染料与细菌生物被膜的结合，在不同波长激光激发下，能清楚地展现生物被膜中各种组分与结构的差异，并能进行逐层扫描展现生物被膜三维立体结构。该技术应用于观察生物被膜空间结构，分布以及抗菌药物对细菌细胞活力的影响，形成样品三维空间结构无须计算机处理。但是检测翻译需要荧光团，观察的分子数量有限，也容易受到荧光探针和天然荧光的干扰。而且不透光样品无法观察[6]。

（四）质谱技术

质谱成像技术是一种基于质谱分析原理检测样品空间分布的分子成像技术。Ding YZ等[7]利用飞行时间二次离子质谱技术（Time-of-flight secondary ion mass spectrometry，TOF-SIMS）检测了生物被膜相关基质成分的空间结构和分布，具有高度的分辨率和灵敏度。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）能够用于测定生物被膜中生物大分子的分子量和鉴定表面的蛋白质，有着操作简便，结果直观的优点。Pereira等[8]使用该技术在聚丙烯表面检测铜绿假单胞菌生物被膜的形成过程， 不仅能够显示生物被膜形成的不同阶段，而且能够用于展示生物被膜分散释放时间。

（五）PCR技术

在检测金黄色葡萄球菌生物被膜时，可利用实时荧光定量PCR方法检测生物被膜形成和调控相关基因（atI，icaA，icaD，icaBC，aap，agr）及胞外DNA基因的差异表达情况，在基因水平研究生物被膜的形成的分子机制。

四、结论

目前，对于金黄色葡萄球菌生物被膜形成和耐药性的研究还有待继续深入，虽然具有多种基于不同原理的生物膜被膜检测技术和方法，但建立简便、准确、灵敏的检测方法，对于生物被膜形成研究以及有效防控生物被膜相关感染性疾病，是今后的重要研究方向。

参考文献

[1]DeLeo FR，Chambers HF.Reemergence of Antibiotic-Resistant Staphylococcus Aureus in the Genomics Era[J].J Clin Invest，2009， 119（9）：2464-2474.

[2]Moormeier DE，Bayles KW.Mol Microbiol.Staphylococcus Aureus Biofilm：A Complex Developmental Organism[J].2017;104（3）：365-376.

[3]祝司霞.细菌生物膜的结构及形成机制的研究进展[J].沈阳医学院学报，2015，17（2）：115-117.

[4]李燕，李冬冬，宋真，等.4種方法检测表皮葡萄球菌生物膜形成能力的应用价值探讨[J].中国实验诊断学，2011，15（3）： 424-427.

[5]李冰，刘晓晨，李琳，等.金黄色葡萄球菌生物被膜基因型的分子鉴定[J].现代食品科技，2015，31（7）：74-79.

[6]胡锦松，陈豪泰，张杰，等.细菌生物被膜鉴定方法的研究进展[J].中国兽医科学，2010，40（11）：1194-1199.

[7]Ding YZ，Zhou YF，Yao J，et al.In situ molecular imaging of the biofilm and its matrix[J].Analytical Chemistry，2016，88（22）：11244-11252.

[8]Pereira FDES，Bonatto CC，Lopes CAP，et al.Use of MALDI-TOF mass spectrometry to analyze the molecular profile of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on glass and plastic surfaces[J].Microbial Pathogenesis，2015，86：32-37.

Abstract： Staphylococcus aureus is an important pathogen causing nosocomial infection. Biofilm is an important virulence factor for Staphylococcus aureus. Many cases of clinical infections are related to biofilm. Understanding the formation mechanism and detection methods of biofilm is very important for controlling the infection and drug resistance， and formulating effective preventive measures and treatment programs. This article reviews the formation and detection methods of Staphylococcus aureus biofilm

Key words： Staphylococcus aureus; biofilm; detection methods