生长抑素联合吉西他滨对人胰腺癌BxPC-3细胞增殖抑制作用的研究*

刘 力 王文婷

湘南学院附属医院，湖南省郴州市 423000

胰腺癌患者死亡率高、预后差，全球范围内5年生存率不足5%，而在我国仅为4%[1-3],究其原因主要与诊断困难及易侵袭转移有关。大量文献报道[4]胰腺癌的主要化疗药物“吉西他滨(Gem)”具有显著耐药性，亦被认为是预后差的原因。故如何提高吉西他滨化疗效果被广大学者重视。针对于此，发现多种药物(姜黄素[5]、维拉帕米[6]、汉防己甲素[7]等)能有效降低吉西他滨的耐药性，提高化疗效果。生长抑素(SST)为临床常用于治疗胰腺疾病的药物，被发现具有多种抗肿瘤作用，其中包括降低肿瘤对化疗药物的耐药性。笔者前期实验发现生长抑素可抑制胰腺导管状乳头癌细胞早期侵袭转移和增强吉西他滨化疗效果。为进一步明确生长抑素在胰腺原位癌细胞中是否同样具有以上效应，本课题组进行了下述实验。通过观察生长抑素联合吉西他滨对人原位胰腺癌细胞 BxPC-3进行干预，监测药物对细胞增殖抑制的影响，寻找临床治疗原位胰腺癌更有效的化疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株BxPC-3购于中国科学院细胞库，吉西他滨及生长抑素购于扬子江集团药业有限公司，DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国Sigma公司，噻唑蓝(MTT)购于MP Biomedicals公司，胎牛血清购于美国Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:BxPC-3细胞在DMEM完全培养基中(包含体积分数10%胎牛血清、50μl/ml青霉素和100μl/ml链霉素双抗)进行培养。将其置于体积分数5%CO2的培养箱中，设置为37℃，待细胞生长良好后，取对数生长期细胞，使用胰酶进行消化，用来配制为细胞悬液；调整细胞密度约为5×104细胞/ml，接种于96孔板中，每孔约5 000细胞数；同样条件下培养24h后使细胞贴壁。取细胞进行下列实验。分别得出吸光度值(OD值)后进行计算，公式：细胞增殖抑制率 = (1-实验组OD值)/对照组OD值。记录结果并制表。

1.2.2 MTT比色法检测生长抑素对细胞增殖影响：(1)在细胞中加入0、100、200、400、600、800μg/ml的SST，分别加入5复孔(此为实验组均为5复孔)，处理24、48、72h；(2)培养好后，吸去各孔内的反应液，使用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗2次，洗去剩余的残留液，在5孔内分别加入20μl MTT(5mg/ml)溶液，加入相应培养液直至100μl，继续在培养箱中培养4h；(3)在每孔内吸干MTT培养液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，使用室温摇床进行震荡，震荡时间5～10min，在波长约490nm处采用酶标仪检测各孔的OD 值，通过公式计算各组细胞增殖抑制率；(4)由以上结果计算SST半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3 MTT比色法检测吉西他滨对细胞增殖影响：(1)在细胞中加入0、0.1、1、5、10、20、40、60μmol/L Gem，按SST IC50的浓度时间，对细胞进行干预处理；(2)干预方法同1.2.2；(3)由以上结果计算出Gem IC50 浓度。

1.2.4 MTT比色法检测联合用药对细胞增殖影响：(1)根据以上实验得出SST、Gem IC50浓度，使用该浓度药物处理，并进行分组：A组:空白对照组，B组：SST IC50，C组：Gem IC50，D组：1/2(SST IC50+Gem IC50)，按SST IC50的时间进行处理。(2)干预方法同1.2.2，计算各组细胞增殖抑制率。计算两药相互作用：q=D组抑制率/B及C组抑制率之和-B及C组抑制率之积。当q值<0.85时，表示SST、Gem具有拮抗作用；当0.85≤q值≤1.15，表示SST、Gem具有相加作用；当q值>1.15时，表示SST、Gem具有协同作用。

2 结果

2.1 各浓度SST对BxPC-3细胞的增殖抑制作用 MTT实验观察SST在不同浓度(0、100、200、400、600、800μg/ml)及不同作用时间(24、48、72h)的情况下，对BxPC-3细胞的抑制效率。SST干预24h后，仅800μg/ml浓度的生长抑素对BxPC-3有抑制作用(P<0.05)；处理48h后，药物浓度为600～800μg/ml处理组较阴性对照组的BxPC-3细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)，但是二组组间差异无统计学意义(P>0.05)；处理72h后，浓度为400～800μg/ml处理组细胞增殖抑制率增加，800μg/ml处理组较600μg/ml处理组显著增加，具有统计学意义(P<0.05)。经ANOVA分析，得出F值为9.279(P<0.01)，表明随时间的增加其抑制率亦增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。当浓度为600μg/ml的SST，在处理72h后，达到半数抑制(SST IC50)。见表1。

表1 SST对BxPC-3细胞增殖抑制

2.2 各浓度Gem对BxPC-3细胞的增殖抑制作用 依据上述实验结果选取Gem干预时间为72h。MTT 实验观察Gem在不同浓度(0、0.1、1、5、10、20、40、60μmol/L)对BxPC-3细胞的抑制效率。结果显示：各浓度Gem对BxPC-3细胞均具有抑制作用(P<0.05)，并且随着药物浓度增加其抑制率增加，呈正相关。当药物浓度为60μmol/L时，BxPC-3细胞增殖抑制率达90%以上。在浓度为20μmol/L Gem干预时达到半数抑制。见表2。

2.3 两药联合对BxPC-3细胞的增殖抑制作用 MTT实验观察600μg/ml SST(B组),20μmol/L Gem(C组)及两药联合(SST 300μg/ml+Gem 10μmol/L)(D组)对BxPC-3细胞的抑制效率。结果显示：B、C组均能抑制BxPC-3细胞的增殖，但D组抑制率明显大于B、C组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。经公式计算两药相互作用q=0.887，提示联合用药具有相加作用。

表2 Gem对BxPC-3O细胞增殖抑制作用

表3 SST和Gem联合作用对BxPC-3细胞增殖抑制作用

3 讨论

胰腺癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球5年生存率低于5%。据国家癌症中心的统计，中国每年新增约1.3%的胰腺癌患者，2015年，胰腺癌的发病概率一路攀升到恶性肿瘤排行的第九位，死亡率排名第六[8]。全球胰腺癌的发病率和死亡率也在迅速增长[9]。预计到2030年，胰腺癌极有可能化身成为美国第二大致命癌症。随着医学生物技术的发展，各种新的癌症治疗方案，如靶向治疗、生物治疗等纷纷出现[10]，然而，由于胰腺癌的复杂解剖学和病理学特征，治疗效果差强人意。其预后如此差的主要原因[11-12]：(1)早期症状不明显，有效诊断难度大；(2)肿瘤存在早期侵袭和转移发生的可能，多数患者无法进行根治性外科手术；(3)对一线化疗药物“吉西他滨”存在显著耐药性。

生长抑素临床常用于治疗急性胰腺炎、胰腺手术后、胃泌素瘤、胰岛素瘤等疾病，并有大量报道发现生长抑素具有多种抗肿瘤作用[13-15]，包括诱导癌细胞凋亡、阻断癌细胞增殖周期、抑制肿瘤血管生成、抑制癌细胞侵袭等。高元平等[16]综合报道了生长抑素的抗肿瘤作用，其中提到生长抑素能降低肿瘤对化疗药物的耐药性，包括垂体肿瘤、肺癌、胆囊癌等。针对于此，笔者设想生长抑素在胰腺癌化疗中有同样效果，降低吉西他滨耐药性，有效提高化疗效果。故开展了本系列实验。通过前期研究，发现生长抑素可抑制人胰腺导管乳头状癌PANC-1和人转移性胰腺癌AsPC-1细胞的增殖，并且能有效增强吉西他滨对人胰腺导管乳头状癌PANC-1的化疗效果。而因胰腺癌早期原位癌病理类型在临床上也很常见，为了进一步阐明生长抑素是否对原位胰腺癌细胞具有相同的作用，本研究小组继续进行了这项实验。BxPC-3细胞株源自原位胰腺癌细胞，故本实验采用胰腺癌BxPC-3细胞作为模式细胞。

在MTT实验中，干预24h后，仅800μg/ml处理组有抑制作用(P<0.05)。在48h后600～800μg/ml处理组具有抑制作用(P<0.05)，但是二组组间差异无统计学意义(P>0.05)。而在72h后，浓度为400～800μg/ml处理组均具有抑制作用，且800μg/ml处理组较600μg/ml处理组显著增加，具有统计学意义(P<0.05)。说明生长抑素需在一定浓度及作用时间方能对BxPC-3细胞起到显著抑制作用。而作为胰腺癌主要化疗药物吉西他滨，它的抑制作用显著存在。实验结果可知各浓度吉西他滨对BxPC-3细胞均具有抑制作用(P<0.05)，并且抑制率与药物浓度呈正相关。依据以上结果计算出生长抑素和吉西他滨半数抑制浓度，用此浓度联合进行干预。结果发现：两者联合用药组抑制率明显大于单药组，差异具有统计学意义。通过计算两药相互作用率q=0.887,表面联合用药具有相加作用，能有效地提高吉西他滨化疗效果，但能否应用于临床尚需在后续临床试验中进行验证。