益气活血方对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响*

石家庄市中医院脾胃科

孟 萍 南月敏△ 赵素贤△(石家庄 050051)

提要 目的：研究益气活血方在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中抑制肝细胞凋亡、阻止肝纤维化进展的作用及机制。方法：将27只Wistar大鼠随机分为3组，模型组和益气活血方治疗组腹腔注射30%CCl4橄榄油溶液，对照组腹腔注射等量橄榄油。益气活血方治疗组以益气活血方中药配方颗粒剂溶液灌胃，另2组大鼠以0.9%氯化钠溶液灌胃。HE、Masson染色观察大鼠肝纤维化程度；肝组织凋亡相关基因FasL、Fas、Bax、Bcl-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3) mRNA表达以qRT-PCR检测，蛋白表达以Western Blot检测。结果：模型组大鼠肝小叶结构紊乱，纤维组织增生形成纤维间隔，并可见假小叶，伴随FasL、Fas、caspase-3mRNA及Bax mRNA及蛋白表达上调，Bcl-2mRNA及蛋白表达下调，与对照组比较差异有非常显著性(P均<0.01)。应用益气活血方肝纤维化明显减轻，FasL、Fas、caspase-3mRNA和Bax mRNA及蛋白表达明显抑制，Bcl-2mRNA及蛋白表达明显上调(P均<0.05)。结论：益气活血方可通过抑制肝细胞凋亡发挥抗炎抗肝纤维化作用。

肝纤维化指肝脏细胞外基质过量堆积致肝组织正常结构功能发生异常改变的严重病理过程。肝细胞凋亡是多种肝脏疾病的共同病理表现，新近研究发现，[1]伴随肝损伤而产生的凋亡可能对肝脏炎症及纤维化产生一定影响，与肝纤维化的持续进展相关。中药有效成分有多途径、多靶点及安全性高的特点，在肝纤维化治疗中具有明显的优势。研究证实，益气活血方可调节肝细胞自噬，减轻肝损伤，抑制肝星状细胞(HSC)活化，促进转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型胶原等降解，进而阻止或逆转肝纤维化。[2-3]然而，其对肝细胞凋亡的影响尚不十分清楚。本研究中，我们利用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，探讨益气活血方是否通过调节死亡受体途径Fas/FasL及线粒体途径Bcl-2/Bax的表达发挥抗肝纤维化作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 选用27只雄性Wistar大鼠，体质量180～220 g，购买于河北医科大学实验动物中心。兔抗GAPDH抗体购自美国Affinity公司；兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗体购自英国Abcam公司；山羊抗兔二抗购自美国ProteinTech公司。益气活血自拟方以黄芪、丹参、云茯苓、白豆蔻、郁金等中药配伍组成，由江阴天江药业有限公司免煎颗粒剂制备冲剂。

1.2 动物模型建立及标本采集 实验大鼠随机分为对照组、模型组和益气活血方治疗组，每组9只。模型组和益气活血方治疗组大鼠腹腔注射30%CCl4橄榄油溶液(0.2 mL/100 g体质量)，对照组大鼠以相同方法给予等量的橄榄油，2次/周。建模的同时，益气活血方治疗组大鼠以自拟益气活血方中药配方颗粒剂溶液灌胃(1 mL/100 g体质量)，其他2组大鼠灌胃等量的0.9%氯化钠溶液，1次/d。于第8周末处死实验大鼠，取出肝脏，适量肝组织以4%中性甲醛溶液固定，余肝组织经液氮快速冷冻，-80℃低温冰箱保存备用。

1.3 肝脏组织病理学检查 固定后的肝组织经透明、包埋、切片，行HE染色及Masson三重染色。于光镜下观察肝纤维化程度。每个标本随机选取5个视野，参照CCl4肝纤维化新型分期标准[4]，对肝纤维化进行评估。

1.4 肝组织FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表达 采用qRT-PCR法，各基因引物序列见表1。Trizol试剂提取肝组织总RNA，应用PrimeScriptTMRT reagent Kit(日本Takara公司)逆转录合成cDNA，以GAPDH作为内参照，应用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行cDNA扩增，反应体系为20 μL。结果运用2-△△CT法进行分析。详见表1。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.5 肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达 取肝组织20 mg，加蛋白裂解液1 mL，4℃研磨成匀浆，经离心分离制备蛋白样品。使用BCA蛋白定量试剂盒定量，每组取总蛋白20 μg上样，12%SDS-PAGE分离蛋白质，湿转恒流37 mA 40 min，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入GAPDH(1∶10 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)抗体，4℃孵育过夜。充分洗涤，分别加入辣根过氧化物酶标记兔抗大鼠第二抗体(1∶20 000)，室温孵育1 h，充分洗涤后，发光、显影、定影、曝光、扫描，以GAPDH为内参照。用扫描仪将硝酸纤维素膜上的蛋白条带扫描至计算机，应用Quantity One软件分析条带灰度。目的蛋白灰度值与内参照蛋白灰度值的比值即为目的蛋白表达量。

1.6 统计学方法 数据处理应用SPSS16.0软件。多组间比较采用单因素方差分析，采用LSD-t检验进行两两比较。P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 益气活血方可减轻CCl4诱发的大鼠肝纤维化 如图1所示，对照组大鼠肝小叶结构完整，未见纤维结缔组织增生(S0)。模型组大鼠肝小叶结构紊乱，纤维组织增生形成纤维间隔，可见假小叶(S5.49±0.23)。应用益气活血方大鼠肝纤维化显著改善，肝小叶结构基本存在(S3.64±0.41)，与模型组相比，差异有非常显著性(P<0.001)，见图2。

注： A HE染色结果(×200)；B Masson染色结果(×200)。

图2 肝纤维化模型组与益气活血方治疗组肝纤维化分期比较

2.2 实验大鼠肝组织FasL、Fas mRNA表达 如图3A所示，qRT-PCR检测结果，肝纤维化模型组FasL、Fas mRNA表达与对照组相比均显著增高(P值均<0.01)，应用益气活血方组大鼠肝组织FasL、Fas mRNA表达水平较模型组明显降低(P值均<0.05)。

2.3 实验大鼠肝组织Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表达 如图3(B、C、D)所示，qRT-PCR及Western blot检测结果，肝纤维化模型组大鼠肝组织Bax mRNA和蛋白表达与对照组相比均明显增加，而Bcl-2mRNA和蛋白表达明显减少(P值均<0.01)；使用益气活血方干预，Bax mRNA和蛋白表达较模型组明显下调，而Bcl-2mRNA及蛋白表达较模型组明显上调(P值均<0.05)。

2.4 实验大鼠肝组织caspase-3mRNA及蛋白表达 如图3(B、C、D)所示，肝纤维化模型组caspase-3mRNA表达明显高于对照组(P<0.001)，应用益气活血方组较模型组明显降低(P<0.01)。Western blot结果显示，caspase-3蛋白表达各组间无明显差异(P>0.05)。

3 讨论

肝纤维化是肌体对慢性肝损伤的一种修复愈合反应，是各种肝损伤的共有病理过程。注射CCl4为建立肝纤维化模型经典方法，广泛应用于防治肝纤维化药物筛选及其作用机制的研究。本研究通过复制经典的CCl4动物模型[5]，注射8周后观察发现，随着CCl4应用，大鼠肝组织纤维结缔组织增生明显，纤维化分期达(S5.49±0.23)，说明肝纤维化大鼠模型制备成功。

肝纤维化多属中医“积聚”“臌胀”等范畴。中药组方在临床上应用于肝脏疾病的预防及治疗，可起到调节免疫，保护肝脏，逆转肝纤维化等作用。益气活血方由黄芪、丹参、云茯苓、白豆蔻、郁金组方而成。方中黄芪为君药，具有补气升阳、益卫固表、利水退肿功效，可促进HSC凋亡，降低胶原沉积，推动胶原降解，降低TGF-β1的含量，且抗炎、免疫调节及抗氧化，有效抗肝纤维化。[6]丹参活血祛瘀、凉血安神，可抑制静止HSC活化，并增强自然杀伤细胞的活化以清除活化的HSC，下调肝组织TGF-β表达。[7-8]云茯苓利水渗湿、健脾，可对抗自由基、抑制肌体的脂质过氧化。[9]白豆蔻可化湿行气、温中止呕，调节TGF-β表达，抑制细胞外基质的合成，缓解肝纤维化程度。[10]郁金具有活血止痛、行气解郁、利胆退黄的功效，可改善肝功能，减轻肝组织炎症反应及氧化应激反应，调节肝细胞免疫，并能阻止肝细胞凋亡。[11-12]本研究在应用CCl4造模的同时予益气活血方灌胃进行干预，结果显示肝组织纤维组织增生减少，纤维化分期降至(S3.64±0.41)，提示益气活血方可减少胶原组织沉积，阻止并逆转肝纤维化。

注：A FasL、Fas mRNA水平变化；B Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA水平变化；C、D Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白表达变化。

研究发现，肝细胞凋亡在肝纤维化的形成和发展中发挥重要的作用，凋亡肝细胞诱导巨噬细胞、HSC及Kupffe细胞吞噬凋亡小体，致使促纤维化因子分泌增多并激活HSC，引起肝纤维化。[13]为了进一步明确益气活血方缓解肝纤维化的分子机制，本研究观察了不同组别大鼠肝组织凋亡通路因子的表达变化。研究结果显示，经CCl4注射8周的肝纤维化模型组FasL、Fas表达明显上调，应用益气活血方干预，可明显抑制FasL、Fas的表达，表明肝纤维化的发生、发展与FasL、Fas的表达及其诱导的肝细胞凋亡有关。Fas是细胞膜表面受体蛋白，其细胞内区传导“死亡信号”的结构域与FasL结合而活化，诱导下游内在及外在细胞凋亡信号转导通路，诱发肝细胞凋亡而致肝纤维化的发生和发展。

线粒体介导的凋亡途径主要受Bcl-2家族调控，Bcl-2和Bax分别为家族中抗凋亡和促凋亡的调控基因。肝细胞发生凋亡时，Bax可破坏线粒体膜的完整性，使线粒体膜电位降低，细胞色素C释放增加，进而与凋亡蛋白酶活化因子-1结合激活caspase-9前体，然后激活caspase-3等，从而诱导细胞凋亡；[14-15]而Bcl-2则在线粒体外膜发挥作用，以维持膜的完整性。[16]Mitchell[17]等应用Bcl-2转基因小鼠肝纤维化模型，发现肝细胞Bcl-2过度表达在肝损伤早期可对抗肝损伤，其机制可能与减轻线粒体功能障碍及脂质过氧化有关。本研究结果提示，Bax在肝纤维化模型组可显著上调，而Bcl-2明显下降，经益气活血方干预后，Bax的表达明显降低，Bcl-2有所升高，说明益气活血方可阻止肝细胞凋亡，减轻肝损伤。

caspase家族是一种半胱氨酸蛋白酶，正常情况下，caspase-3以无活性的酶原形式存在于细胞内。当作为传感器的细胞表面死亡受体Fas接受由死亡配体FasL发出的死亡信号，使Fas激活，并传递到细胞内，激活caspase家族成员，借助凋亡信号结构域(死亡效应域、caspase“募集”结构域)导致caspase成员相继激活，最终使caspase-3激活，进而降解特定的靶蛋白，导致细胞死亡。[18]caspase-3是死亡受体通路、线粒体通路及其内质网应激通路的汇聚点，是凋亡过程的中心环节和关键执行者。[19]本研究发现，模型组caspase-3mRNA的表达较对照组明显上调，益气活血方干预后caspase-3表达减少，表明由于Fas的激活，进一步通过信号转导激活caspase-3，与疾病的进展密切相关，随着纤维化的形成而表达增强，促使细胞凋亡。研究证实，在大鼠模型中应用caspase阻滞剂可抑制肝细胞凋亡，明显减轻肝纤维化。[20]

笔者研究发现，益气活血方可抑制CCl4导致的肝细胞凋亡，阻止肝纤维化进展，其可能的机制为：CCl4诱导可产生大量的自由基，在细胞膜上发生脂质过氧化反应，生成氧自由基增多，激活FasL/Fas系统，进一步激活caspase家族中的caspase-3，形成蛋白酶促级联反应，激活核酸内切酶，致DNA断裂、染色体浓缩，最终导致细胞凋亡。而益气活血方可对抗自由基，降低肝组织氧化应激反应，抑制FasL/Fas系统的激活，上调线粒体途径Bcl-2/Bax比例，继而抑制caspase-3的激活，从而抑制细胞凋亡。

综上所述，益气活血方对CCl4所致的大鼠肝损伤起到保护作用，其机制可能通过抑制肝细胞凋亡，有效阻止或延缓肝纤维化的形成。益气活血方抗纤维化机制的研究结果为其在临床的应用提供了理论依据。