新甘草酚对HepG2 人肝癌细胞增殖的影响及机制研究

范敏慧 何晓其 吴亚萍

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大最常被诊断的癌症，也是导致癌症相关死亡的第四大原因[1]。放化疗及靶向药物索拉非尼、仓伐替尼是目前HCC 的主要治疗方法，但HCC 患者的总体预后仍然不理想[2-3]。研究表明，甘草可通过抑制肝癌增殖、迁移和促进细胞凋亡等多条途径抑制原发性肝癌的发生和发展，并在肝癌介入放疗患者中有重要的保护作用[4-6]。新甘草酚是甘草酚类单体的组分之一[7]，本研究探讨新甘草酚对人肝癌细胞HepG2 细胞增殖的影响和机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株 HepG2 人肝癌细胞购自ATCC（ATCC HB-8065TM，货号：a263215）。

1.2 试 剂 高糖DMEM 基础培养基（批号2651）、胎牛血清（批号54685）购自美国Sigma 公司；新甘草酚（批号74874）购自南京道斯夫生物科技有限公司；pan-Akt 激酶抑制剂Capivasertib（批号215451）购自上海蓝木化工有限公司；索拉非尼（批号BXHR3E2，规格0.2g）购自德国拜耳医药保健股份公司；CCK8 试剂盒（批号25691）、流式细胞周期检测试剂盒（批号457845）均购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA simple 总RNA 提取试剂盒（批号453226）购自天根生化科技（北京）有限公司；RIPA中裂解液（批号165212）、蛋白酶抑制剂（批号15441）、磷酸酶抑制剂（批号92659）购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸肌醇3 激酶（PI3K）兔单抗（批号87675）、磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）兔单抗（批号6258）购自美国abcam 公司；蛋白激酶B（Akt）兔单抗（批号1864）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）兔单抗（批号674564）购自美国CST 公司。

1.3 仪 器 VE 680 微型垂直电泳设备，上海天能科技有限公司；Odyssey 双色红外荧光成像系统，美国LI-COR 公司；CelMate 二氧化碳培养箱，Esco Lifesciences，新加坡艺思高科技有限公司；FACSAriaTMⅢ流式细胞仪，美国BD 公司；酶标仪SpectraMax 5，美谷分子仪器（上海）有限公司；HerasafeTM2030i Biological Safety Cabinets 生物安全柜，美国赛默飞公司；CFX96 Touch 荧光定量PCR检测系统，BIO-RAD 仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；-80℃超低温冰箱，美国赛默飞公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组处理 HepG2 人肝癌细胞培养方式：含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基，细胞密度达到80%～90%时传代。细胞增殖、细胞周期、荧光定量PCR（RT-PCR）、蛋白免疫印记（WB）实验分为空白对照组、新甘草酚低（10μmol/L）、中（20μmol/L）、高剂量组（40μmol/L）、索拉非尼组（10μmol/L）。新甘草酚、索拉非尼分别加入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶解备用。各组分别加入相应药物、空白对照组以PBS 处理细胞24h。Akt 抑制剂实验分为对照组（DMSO），pan-Akt抑制剂组（20μmol/L），Capivasertib 用DMSO 溶解备用。相应药物处理12h 提取细胞RNA 进行RT-PCR实验。

2.2 CCK8 细胞增殖实验 将HepG2 细胞以1 万细胞/孔铺板于96 孔板，每组5 个复孔，铺板12h 后按2.1 分组处理，处理24h 加入CCK8 试剂10μL，2h 后利用酶标仪检测450nm 波长处吸光度值，以空白对照组24h 吸光度值为内参，计算细胞活力相对百分率。

2.3 流式细胞术检测细胞周期 将HepG2 细胞以40%密度铺板于6 孔板中，铺板12h 后按2.1 分组处理24h，消化细胞至EP 管中按照流式细胞周期检测试剂盒说明书操作，最后利用流式细胞仪检测细胞周期，记录仪器各细胞周期百分率。

2.4 RT-PCR 检测cyclin D1、cyclin A 表达 HepG2细胞铺板后按2.1 分组，其中空白对照组、新甘草酚低、中、高剂量组、索拉非尼组处理细胞24h，Akt 抑制剂实验对照组、pan-Akt 抑制剂组处理细胞12h。按照RNAsimple 总RNA 提取试剂盒提取总RNA，逆转为cDNA 后进行RT-PCR，PCR 引物如下：cyclin D1（正向引物：5'-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3'；反向引物：5'-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3'）、cyclin A（正向引物：5'-CCTGCGCGAGAAGGAACTG-3'；反向引物：5'-CGTTGTAGCGATCCATGAAGTG-3'）。RT-PCR 程序：变性，95℃，30s；退火，60℃，30s；延伸，72℃，30s。以GAPDH 作为内参，通过循环数计算各基因mRNA 表达情况。引物均购自苏州金唯智生物科技有限公司。

2.5 WB 检测PI3K-Akt 信号活化 HepG2 细胞按2.1 分组处理24h 后，取出细胞，预冷PBS 洗1 遍后，加入细胞裂解液冰上裂解30min 后，转移至EP 管中，经离心后取上清测定蛋白浓度。定量至1μg/μL，蛋白跑电泳上样20μg，经电泳、转膜封闭后，4℃孵育一抗过夜，第二天洗去一抗后室温孵育荧光二抗1h。Odyssey 双色红外荧光成像系统扫描分析结果。

2.6 统计学方法 应用SPSS 23.0 统计软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差（） 表示，两两比较采用SNK-q 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 新甘草酚有效抑制HepG2 细胞增殖 CCK8 实验结果显示，与空白对照组比较，新甘草酚低、中、高剂量组对HepG2 细胞的增殖均具有明显抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。与索拉非尼组比较，低、中剂量新甘草酚组HepG2 细胞增殖的抑制效果降低（P＜0.05），而高剂量新甘草酚组HepG2 细胞的增殖抑制作用与索拉非尼组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组HepG2 细胞活力百分率比较（%，）

表1 各组HepG2 细胞活力百分率比较（%，）

注：空白对照组为PBS 处理细胞；索拉非尼组为索拉非尼（10μmol/L）处理细胞；新甘草酚低、中、高剂量组分别为10、20、40μmol/L 新甘草酚处理细胞；与空白对照组比较，aP＜0.05；与索拉非尼组比较，bP＜0.05

3.2 新甘草酚对HepG2 细胞周期的抑制作用 细胞周期研究显示，与空白对照组比较，新甘草酚低、中、高剂量组G0/G1 期细胞明显减少（P＜0.05），而中、高剂量组G2/M 期细胞明显增加（P＜0.05），表明中、高剂量组新甘草酚明显抑制HepG2 细胞DNA复制和细胞分裂的过程。与索拉非尼组比较，高剂量组G0/G1 期细胞减少，G2/M 期细胞增加（P＜0.05），见表2。

表2 各组HepG2 细胞周期百分率比较（%，）

表2 各组HepG2 细胞周期百分率比较（%，）

注：空白对照组为PBS 处理细胞；索拉非尼组为索拉非尼（10μmol/L）处理细胞；新甘草酚低、中、高剂量组分别为10、20、40μmol/L 新甘草酚处理细胞；与空白对照组比较，aP＜0.05；与索拉非尼组比较，bP＜0.05

3.3 新甘草酚抑制细胞增殖标志物cyclin D1、cyclin A 表达 RT-PCR 检测细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin A 的表达实验显示，与空白对照组比较，新甘草酚中、高剂量组对cyclin D1、cyclin A mRNA 的表达均具有明显抑制作用（P＜0.05）。与索拉非尼组比较，新甘草酚中剂量组对cyclin D1、cyclin A 抑制作用相对降低（P＜0.05），而高剂量组抑制作用与索拉非尼组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3.4 新甘草酚抑制PI3K-Akt 信号 WB 实验显示，与空白对照组比较，索拉非尼组及新甘草酚低、中、高剂量组对p-PI3K、p-Akt 的磷酸化水平均具有明显的抑制作用。应用pan-Akt 激酶抑制剂Capi-vasertib 处理细胞发现，与对照组比较，pan-Akt 抑制剂组cyclin D1 mRNA 表达明显降低。表明新甘草酚可能通过PI3K-Akt 信号抑制了肝癌细胞的增殖。见图1、表4。

表3 各组HepG2 细胞cyclin D1、cyclin A mRNA相对表达量比较（）

表3 各组HepG2 细胞cyclin D1、cyclin A mRNA相对表达量比较（）

注：空白对照组为PBS 处理细胞；索拉非尼组为索拉非尼（10μmol/L）处理细胞；新甘草酚低、中、高剂量组分别为10、20、40μmol/L 新甘草酚处理细胞；cyclin D1 为细胞周期蛋白D1；cyclin A 为细胞周期蛋白A；与空白对照组比较，aP＜0.05；与索拉非尼组比较，bP＜0.05

图1 新甘草酚对PI3K-Akt 信号的影响

表4 各组cyclin D1 mRNA 相对表达量比较（）

表4 各组cyclin D1 mRNA 相对表达量比较（）

注：对照组为DMSO 处理细胞；pan-Akt 抑制剂组为Capivasertib（20μmol/L）处理细胞；cyclin D1 为细胞周期蛋白D1；与对照组比较，aP＜0.05

4 讨论

研究显示，中药甘草有效成分体外能有效诱导多种肝癌细胞凋亡[8]，目前已有复方甘草甜素应用于临床治疗原发性肝癌的报道[9]，提示甘草在肝癌的防治中具有重要的作用。甘草酚是近来发现的一种甘草的有效单体成分。本研究中CCK8 细胞活力检测表明，新甘草酚能有效抑制肝癌细胞HepG2 增殖（P＜0.05）。细胞周期实验发现，新甘草酚处理HepG2细胞后，G2/M 期细胞比例明显增加（P＜0.05），而G0/G1 期细胞比例明显减少（P＜0.05）。提示新甘草酚通过调控肝癌细胞周期抑制细胞增殖。Cyclin D1、cyclin A 是调控细胞周期的关键分子[10]。本研究通过RT-PCR 检测发现新甘草酚明显降低了cyclin D1、cyclin A mRNA 的表达（P＜0.05）。提示新甘草酚可能通过调控细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin A的表达调控肝癌细胞周期，从而抑制其增殖。

PI3K-Akt 信号在HCC 细胞增殖、迁移和细胞周期调控过程发挥着至关重要的作用。Zhang 等[11]研究发现，长非编码RNA uc.338 促进结直肠癌细胞增殖，可能通过PI3K-Akt 通路靶向调节肿瘤细胞p21下调和Cyclin D1 上调。Ye 等[12]研究发现，人肝细胞癌中βKlotho 表达下调，过表达βKlotho 明显抑制肝癌细胞增殖，同时表达βKlotho 明显降低Akt 和GSK-3β 的磷酸化水平并诱导下调cyclin D。以上研究均提示PI3K-Akt 信号在调控cyclin D1 诱导的细胞增殖中发挥着重要的作用。本研究结果显示，新甘草酚能够明显抑制肝癌细胞PI3K-Akt 信号通路的活化，并且抑制cyclin D1 的表达（P＜0.05）。Akt 抑制剂实验显示，Akt 抑制剂能够明显降低cyclin D1 的表达（P＜0.05），认为新甘草酚可能通过PI3K-Akt正向调控cyclin D1 表达。

综上所述，本研究发现甘草单体成分新甘草酚能有效抑制人肝癌细胞HepG2 的增殖，其作用机制可能与PI3K-Akt 信号活化、细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin A 调控的细胞周期相关。