鸡粪堆肥发酵过程微生物数量与温度及酶变化的相关性研究

敖 静, 李 杨, 刘晓辉, 高晓梅, 孙玉禄

(辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 22000)

畜禽粪便堆肥发酵是一种较为常用的固体废弃物资源化处理手段，自然堆肥存在周期长、气味大、发酵不完全等问题，需要人工添加腐熟剂提高堆肥发酵效率。堆肥发酵的本质实际上是微生物繁殖代谢有机物的过程[1]，在这个过程中，大量微生物和酶参与，将有机物分解利用转化为无机态养分[2]。温度也是堆肥过程中反应堆肥进程的重要参数，一般堆肥发酵都要经过起火、高温、降温、二次升温、降温等阶段，在不同阶段，微生物种类和活跃程度也有所不同，发酵过程中各种酶的变化趋势可以反映部分微生物的活跃趋势以及发酵程度[3]。微生物对有机物的分解代谢能力取决于酶的活性，不同的微生物分泌的酶的种类不同，堆肥底物越丰富多样，所需要的酶系统就越复杂[4]。因此，对堆肥过程中微生物数量和温度及酶的变化进行研究，有利于了解堆肥的生化过程，为进一步了解堆肥发酵中微生物的作用，更好地控制堆肥发酵工艺，以及微生物菌剂的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验原料 鸡粪由辽宁省朝阳市兴和牧业有限公司提供；杏鲍菇菌糠由辽宁省微生物科学研究院提供。各营养成分含量见表1。

1.1.2 培养基(g/L) ①NA培养基：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂粉18，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。②PDA培养基：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉18，蒸馏水1 L，pH自然。③高氏1号培养基：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，FeSO4·7H2O 0.01，KNO31.0，MgSO40.5，NaCl 0.5，琼脂粉18，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 堆肥测温及取样 将杏鲍菇菌糠粉碎成渣，按15%(质量分数)的比例添加到鸡粪中，将物料堆置在通风的温室大棚内，堆成高约1 m，直径约1.5 m的圆垛，堆体无需覆盖。每天分别在10：00和15：00进行两次测温，将温度计插入堆料中央处15～20 min，测定3次，取平均值作为堆料温度。分别在发酵第3、6、9、12、15、18、21、24、27 和30天取样。采取多点混合法，分别在堆体的上、中、下三个部位取样，并充分混合，新鲜样品直接测定或冰箱4 ℃保存备用。

1.2.2 堆肥过程中微生物数量测定 采用NA培养基、PDA培养基和高氏1号培养基，分别对细菌、真菌和放线菌进行培养[5]。采用平板计数法进行菌数测定。

1.2.3 堆肥过程中酶测定 ①纤维素酶测量(硝基水杨酸比色法[6])：称取0.50 g堆料样品于150 mL 的锥形瓶中，加入1%羧甲基纤维素钠溶液20 mL、磷酸盐缓冲液5 mL(pH值5.3～5.6)、甲苯1.5 mL，37 ℃培养72 h，过滤，滤液定容至25 mL，取1 mL滤液在540 mm处测光密度(A)，设置空白对照组。以培养72 h的1 g堆肥样生成的葡萄糖mg数表示纤维素酶活性(单位：mg/(g·d)。②脲酶测定(靛酚蓝比色法[7])：称取堆料样品5.00 g于100 mL的容量瓶中，加入甲苯1 mL，静置15 min，然后加入尿素10 mL(10%)、柠檬酸盐溶液(pH 6.7)20 mL，缓慢摇晃至液体混合均匀，37 ℃恒温培养24 h，然后37 ℃蒸馏水稀释定容，过滤，取2 mL滤液，加入10 mL蒸馏水，4 mL苯酚钠，3 mL次氯酸钠，充分震荡，静置20 min，稀释至50 mL。1 h内578 nm处测A值，设置空白对照组。尿酶活性以24 h后100 g土壤中NH3-N的mg数表示(单位：mg/(g·d))。③蔗糖酶测定(硝基水杨酸比色法[8])：称取0.50 g堆料样品于150 mL的锥形瓶中，加入15 mL蔗糖溶液(18%)、5 mL磷酸盐缓冲液、5滴甲苯，缓慢摇晃至液体混合均匀，38 ℃恒温培养24 h，过滤，取1 mL滤液于比色管中，加入3 mL水杨酸，水浴锅沸水加热，待溶液呈现黄色停止加热并冷却，蒸馏水定容至50 mL，在580 nm处测定A值，设置空白对照组。以堆制24 h的1 g堆肥样品所生成的葡萄糖mg数表示蔗糖酶活性(单位：mg/(g·d))。④过氧化氢酶测定(高锰酸钾滴定法[9])：称取0.50 g堆料样品于150 mL的锥形瓶中，加入蒸馏水40 mL、H2O250 mL(3%)，密封处理后震荡25 min，加入H2SO45 mL(1.5 mL/L)，过滤，取25 mL过滤液，0.02 mol/L KMnO4溶液滴定至微红色，设置空白对照组。过氧化氢酶活性以单位堆肥样品所消耗的0.02 mol/L KMnO4溶液的mL数表示(单位:mL/(g·25 min))。

1.2.4 分析方法 使用软件IBM SPSS Statistics 21进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中微生物数量与堆体温度的相关性

在堆肥发酵过程中，细菌是数量最多的微生物，堆肥初期嗜温细菌数量较多，在这个阶段提供细菌生长繁殖的营养物质主要是易分解的糖类[10]。随着发酵的继续，堆体温度逐渐升高，细菌主要以嗜热的芽胞杆菌属为主，最低生长温度为30～45 ℃，具有多样性的生理特性[11]。随着嗜热细菌的活性降低，堆体温度也逐渐下降，嗜温细菌又重新发挥作用，继续利用剩余的营养物质，直到发酵过程结束。由图1可以看出，堆肥发酵初期细菌数量为8.23×109cfu/g，随着发酵的继续，菌数逐渐增加， 6 d时菌数最高达16.8×109cfu/g。当发酵到12 d后，菌数有所下降，18 d发酵二次升温，菌数有所增加，随后又逐渐减少。细菌数量变化规律为增加、减少、增加、减少、稳定。

图1 细菌数量与堆体温度的变化曲线Fig.1 Change curve of the number of bacteria and the temperature in the composting material

真菌生长温度为30～50 ℃，在发酵过程中对纤维素的分解起到一定作用[12-13]。由图2可以看出，真菌菌数的变化与温度关系密切，随着温度升高，菌数也随之增加，发酵达到高温阶段嗜热真菌起主要作用。当发酵9 d时，真菌数量达到峰值14.3×104cfu/g，12 d后，菌数有所减少，当发酵第二次升温时，真菌菌数略有增加，之后开始下降直到发酵结束，可培养真菌菌数约为4.3×104cfu/g。

图2 真菌数量与堆体温度的变化曲线Fig.2 Change curve of the number of fungus and the temperature in the composting material

放线菌大多数为好氧菌，在堆肥发酵初期，与其竞争的其他微生物较少，所以发酵初期放线菌菌数较多[14]，由图3 可以看出，6 d时菌数开始增加，9 d时达到峰值22.3×106cfu/g，之后随着发酵的继续，放线菌数开始下降。

图3 放线菌数量与堆体温度变化曲线Fig.3 Change curve of the number of actinomycetes and the temperature in the composting material

利用SPSS软件，将细菌、真菌、放线菌数量分别与温度进行Pearson拟合，结果如表2、表3和表4所示，细菌、真菌数量与温度的显著性差异值分别是0.046和0.034，在置信水平为0.05的条件下，认为细菌、真菌数量与温度具有相关性，即95%的概率认为细菌、真菌菌数与堆体温度呈正相关；放线菌数量与温度无显著相关性。

2.2 堆肥过程中微生物数量与酶活的相关性

纤维素在自然界的存在十分广泛，但由于其难破坏、难降解的特性，很难被直接利用。堆肥发酵过程中，大量的酶起着至关重要的作用，纤维素酶在分解纤维素时起到促进作用，可以将纤维素分解成寡糖或单糖，有利于微生物的分解和利用。畜禽粪便中的纤维素既可以为微生物的生命活动提供能源，又可以为其提供碳源，在纤维素酶的水解作用下，纤维素被分解利用，所以可以通过纤维素酶的变化作为堆肥过程碳源利用的表征。在堆肥过程中，纤维素酶由大部分细菌和真菌产生[14]，研究纤维素酶与菌数的关系要看总的微生物数量，在试验中，由于真菌和放线菌菌数相对于细菌菌数来说极少，可忽略不计，所有本研究中总菌数数据由细菌菌数代替。由图4可以看出，纤维素酶变化趋势与总菌数相近，发酵至6 d时，总菌数最多，此时的纤维素酶达到峰值16.8 mg/(g·d)，随后开始下降，18 d时随着菌数的增加，纤维素酶又呈上升趋势，之后菌数降低，发酵结束，纤维素酶也降至8.3 mg/(g·d)。

表2 堆肥过程中细菌数量与温度的相关性

表3 堆肥过程中真菌数量与温度的相关性

表4 堆肥过程中放线菌数量与温度的相关性

图4 纤维素酶与总菌数变化曲线Fig.4 Change curve of the cellulase and the total number of bacteria

过氧化氢酶主要存在大多数细菌中，是一种末端氧化酶，催化过氧化氢分解成氧和水，在细胞体内起到了关键的生物防护作用[16]。过氧化氢酶能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。堆肥的过氧化氢酶活性，与其呼吸强度和微生物活动相关，在一定程度上反映了堆肥微生物学过程的强度[17]。由图5可以看出过氧化氢酶与细菌菌数变化趋势相近，在发酵初期6 d时达到峰值，随后随着菌数的下降，过氧化氢酶也逐渐下降，18 d时细菌菌数增加，活跃度提高，过氧化氢酶也随之略有增加，之后继续呈下降趋势。

脲酶是尿素氨基水解酶类的总称，是一种由简单蛋白质构成，具有氨化作用的水解酶。能够催化尿素分解生成碳酸和两分子氨，并释放出NH3和CO2，具有高度专一性[18]。脲酶的活性与氮素代谢密切相关，脲酶活性反映了堆肥过程中含氮物质的矿化过程，是堆肥腐熟度的评价指标之一。在堆肥过程中，脲酶由有细菌、真菌和放线菌产生，研究表明，脲酶的活性与微生物量呈正相关，由图6可以看出，脲酶在发酵初期较高，随后逐渐下降，这可能是由于高温期过后，微生物数量减少导致的。

图5 过氧化氢酶与细菌数变化曲线Fig.5 Change curve of the catalase and the number of bacteria

图6 脲酶与总菌数变化曲线Fig.6 Change curve of the urease and the total number of bacteria

鸡粪的干物质中粗蛋白占31%～33%，在鸡粪发酵过程中，蛋白的分解关系到堆肥发酵的腐熟程度和发酵后的肥料品质。蛋白酶是水解酶的一种，其主要由细菌产生，不仅可以反映蛋白的分解程度，还能体现细菌的活跃程度[19]。由图7可以看出，发酵初期蛋白酶含量较高，随着发酵的继续前期略有增加为70.9 mg/(g·d)，随着发酵的继续，总体呈减少趋势，这可能是蛋白质被分解而减少造成的。

利用SPSS软件进行Pearson相关性分析，由表5可以看出，纤维素酶与总菌数的显著性差异值为0.02，在置信水平为0.05的条件下，认为纤维素酶和总菌数具有相关性，即95%的概率认为纤维素酶和总菌数呈正相关；由表6可以看出，过氧化氢酶与细菌菌数的显著性差异值为0.00，在置信水平为0.01的条件下，认为过氧化氢酶与细菌菌数具有相关性，即99%的概率认为过氧化氢酶与细菌菌数呈正相关。由表7和表8的数据得出，脲酶和蛋白酶与菌数无显著相关性

图7 蛋白酶与细菌菌数变化曲线Fig.7 Change curve of the protease and the number of bacteria

表5 堆肥过程中纤维素酶与总菌数的相关性

表6 堆肥过程中过氧化氢酶与细菌菌数的相关性

表7 堆肥过程中脲酶与总菌数的相关性

表8 肥过程中蛋白酶与细菌菌数的相关性

3 讨 论

本研究在鸡粪发酵的不同阶段测定了微生物菌数和堆体温度及酶活的变化情况，通过曲线直观地看出细菌和真菌的菌数的变化趋势与堆体温度变化趋势相近，利用SPSS软件进行Pearson 相关性分析得出，细菌、真菌数量与堆体温度的显著性差异值分别是0.046和0.034，在置信水平为0.05的条件下，认为细菌、真菌数量与温度具有相关性，即95%的概率认为细菌、真菌菌数与堆体温度呈正相关；而通过软件数据分析可以得出，放线菌菌数与堆体温度无显著相关性，这可能是由于放线菌大多数为好氧菌，在发酵初期氧气充足，菌数比较高，但由于发酵进程的继续，堆体的浓缩效应导致堆体内部氧气减少，从而影响了放线菌的数量。

通过测定纤维素酶、过氧化氢酶、脲酶和蛋白酶，比较多种酶类与微生物菌数的关系，由曲线图可以看出，纤维素酶和过氧化氢酶的变化趋势与菌数的变化趋势相近，通过SPSS分析可知，纤维素酶和总菌数具有相关性，95%的概率认为纤维素酶和总菌数呈正相关，99%的概率认为过氧化氢酶与细菌菌数呈正相关；脲酶和蛋白酶与菌数无显著相关性，二者都参与发酵过程中氮的循还，这两种酶也与微生物的数量和活跃度有关，出现无相关性的数据可能是由于底物在酶促反应中减少，导致这两种酶总体呈下降趋势。

通过本研究可以了解微生物数量和酶活在堆肥发酵过程中的相关性，可为畜禽粪便堆肥发酵，有针对性的添加菌剂，为更准确高效的利用有机废弃物提供参考。