鱼类细菌性病原分离鉴定新方法

目前鱼类主要微生物病原包括细菌、真菌及病毒等，其通用的分离鉴定方法主要是培养法，即选择合适的培养基对目标生物进行培养、纯化，继而开展相关鉴定工作，其最重要的关键点即培养微生物。病原微生物分离纯化技术的发展给鱼类病原微生物鉴定带来极大便利，推动了鱼类病原学的革命性发展。随着研究的深入及新技术的发展，我们认识到并非所有病原微生物均可培养。而随着养殖环境的恶化，鱼类病原呈现多样性，一些不可培养的(或者常规条件难以培养)细菌、真菌也可能成为鱼类病原菌，因此迫切需要革新病原分离鉴定的技术。本文以黄颡鱼腹水病病原分离鉴定为例，介绍一种新的鱼类细菌性病原分离鉴定方法，供同行参考。

一、16S rDNA高通量测序技术

16S rDNA 高通量测序技术是主要基于细菌16S rDNA 基因在功能上的高度保守性以及又有一定程度的高变性，可以真实全面地反映样品中细菌群落结构，从而检测到可培养以及不可培养的细菌种类。随着现代高通量测序技术的发展，16S rDNA 高通量测序技术已经被普遍使用于各个领域进行细菌多样性分析。针对水生动物细菌性病原，可采取16S rDNA 高通量测序技术来解决难培养或者不能培养的细菌感染引起的疾病病原确定问题，直接取病样测序获取发病鱼相应病灶部位及相关组织器官细菌群落，通过高通量获取细菌种属信息，从而对可分离培养的细菌制定针对性的分离培养措施，对不可培养细菌也可了解其大致信息以便进行毒力相关研究。

二、应用实例

1.流行病学调查 荆州某黄颡鱼养殖场暴发腹水病，笔者对养殖情况、周边环境、发病史及用药情况进行调查，分析黄颡鱼发病的典型症状，并取样进行液氮保存带回实验室进一步分析。

2.16S rDNA 细菌多样性分析 在无菌条件下，取6 尾具典型患病症状的黄颡鱼置于操作台上，用灭菌剪刀将黄颡鱼腹部戳破，将腹水分别装入两支10毫升的离心管中，一支加入20%甘油置于-80℃冰箱保存待用，另一支送至上海美吉生物医药科技有限公司抽提DNA 并在Illumina Mi-Seq平台上进行高通量测序。

3.特定细菌分离 基于细菌16S rDNA 多样性测序结果，此次患病黄颡鱼的腹水中气单胞菌属种类占据绝对优势，因此使用谷氨酸盐淀粉酚红琼脂从腹水中分离优势菌，即用接种环蘸取保存的腹水划线于平板上，28℃培养24 小时后挑取单菌落进一步纯化，纯化后的细菌加入20%甘油保存于-20℃备用。分离菌株命名为HS01。

4.病原确诊 经人工感染试验，病菌HS01 确定为本次黄颡鱼腹水病病原，通过理化特性测定及保守基因分型，确定分离株HS01 为嗜水气单胞菌，从而确定本次黄颡鱼暴发溶血性腹水病的病原是嗜水气单胞菌。

三、讨论

当前水生动物细菌性疾病暴发症状呈现多样性，细菌性病原种类繁多，对于如何确定细菌性病原变得更加艰难。传统水生动物细菌性病原的确定方法是通过直接对细菌性病原进行分离培养，从而获得细菌的纯培养物，其后利用细菌的纯培养物进行回归感染，看是否出现自然感染症状，如出现则进一步对纯培养物进行鉴定，如若不是则进行纯化细菌。

传统方法在细菌病原确定方面严格遵循了科赫法则，是确定细菌病原的金标准。但随着现代研究的深入以及细菌病原不断增多，传统病原确定方法暴露出了不少缺点，主要集中在病原分离培养方面。传统细菌性病原确定方法的关键手段是获得细菌性纯培养物，而细菌性病原培养条件各不同，有的甚至很苛刻，有厌氧的，有喜寡养，有亲富营养的，有本身会自噬的以及其他特殊条件要求等。

我们进行细菌性病原分离时通常使用的是普通培养基如营养琼脂等或者营养丰富的培养基如脑心浸出液等，更进一步用一些常用的选择性培养基如TCBS 等，培养条件常为28℃有氧恒温培养，对于一般常见水生动物细菌性病原能够分离到，有时杂菌率比较高。而对于一些有特殊要求的病原可能就很难分离纯化到，不长或者长得不如常见微生物好的情况经常遇到，还有一些种类是不可培养的，所以导致一部分细菌性疾病病原始终无法准确确定，给细菌性疾病病原确定带来了严重障碍。

16S rDNA 高通量测序技术的引入，使得本次确诊更加可信，也改正了传统水生动物细菌性病原确定的缺点，是对传统方法的补充与完善。