噬菌体在畜禽养殖中应用的研究进展

罗巧慧， 兰翠英， 邓继彦， 魏堂鸿， 罗何峰

（四川德康农牧食品集团股份有限公司，四川成都610200）

长期以来，饲用抗生素在饲料工业中的应用取得了良好的效果，也对养殖业的发展起到了至关重要的作用。但是，因长期滥用抗生素而引起的耐药性问题正呈逐年增长趋势。这不仅给养殖业带来了严重的损失，而且危及到了人类的健康。因此，替代抗生素的各种策略不断被提出，抗菌肽、噬菌体、微生态制剂等都是热门研究对象，其中有关噬菌体的研究更是受到了广泛的关注。

噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成增殖，通过裂解细菌将自身释放到环境中的微生物（李跃，2014）。噬菌体在1896年被发现并引起广泛关注，但随着后来抗生素的发现和应用使得噬菌体的研究处于停滞状态。直到20世纪80年代，由于多重耐药菌的出现，研究者们又开始重视噬菌体的研究。与抗生素治疗相比，噬菌体治疗具有代谢效率低、杀死细菌的最低剂量低、高度的特异性、高效的杀菌效果、筛选速度快等优势（顾敬敏，2014）。近年来，有关噬菌体的研究有了巨大的发展，国内外对噬菌体的应用研究范围很广，包括针对人类疾病的防治、动物疾病的防治、食品中病原菌的清除、农作物的细菌感染防治、细菌生物被膜的裂解等方面。本文着重阐述了噬菌体的生物学特性，目前的噬菌体产品，以及其在禽类、猪、反刍动物养殖生产中的应用，以期为噬菌体在动物生产中的应用提供参考。

1 噬菌体的生物学特性

1.1 噬菌体的结构 噬菌体的长度变化很大，通常为24～200 nm，T4噬菌体是最大的噬菌体之一，长约200 nm，宽80～100 nm （Sharma等，2017）。噬菌体结构比较简单，主要由蛋白质外壳和遗传物质核酸组成，而蛋白质外壳主要包括头部和尾部，以T4噬菌体为例，其蛋白外壳还包括颈部、尾管、尾鞘、基片、尾针、尾丝等（李振，2018；张建城，2017）。噬菌体分布广泛，有细菌的地方都可能有相应噬菌体的存在，地球上大约存在1031种噬菌体（Sharma 等，2017）。

1.2 噬菌体的分类 目前，国际病毒命名委员会（ICNV）将噬菌体分为15个科，而其中属于有尾噬菌体目的噬菌体约占96%，并且根据其尾部形态结构，又分为短尾噬菌体科（Podoviridae）、长尾噬菌体科（Siphoviridae）和肌尾噬菌体科（Myoviridae），其数量分别占有尾噬菌体总数的14%、61%和25% （李振，2018；张建城，2017）。而根据噬菌体中所含核酸的种类，又可分为单链RNA（ss RNA）、双链 RNA（ds RNA）、单链 DNA（ss DNA）、双链DNA（ds DNA），目前发现的噬菌体绝大多数属于ds DNA（张建城，2017）。此外，根据蛋白质外壳分类，噬菌体又可分为无尾的二十面体结构和有尾的二十面体结构以及线状体（呈线状，没有明显的头部结构，是由壳粒组成的盘旋状结构），现已知的噬菌体大多为有尾的二十面体结构（许东勤，2018）。

根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为温和噬菌体和烈性噬菌体，烈性噬菌体感染宿主后进入裂解性周期，其尾部蛋白与细菌宿主表面的受体特异性地结合，并将其自身的遗传物质注入宿主细胞后，借助宿主细胞的代谢系统来复制核酸、合成蛋白质及各种所需的酶类，随后宿主细胞在烈性噬菌体基因编码的蛋白（如溶菌酶、穿孔素等）的作用下从内部裂解，释放子代噬菌体至环境中继续侵染其他细菌（魏炳栋等，2020）。而温和噬菌体感染宿主后进入溶源性周期，其将遗传物质注入宿主细胞以后，将其整合至宿主基因组中，随着宿主细胞的分裂而不断遗传下去，但当宿主遇到恶劣环境（如电离辐射、诱变剂等）后，溶源性周期终止，进入裂解性周期，释放子代噬菌体裂解宿主 （魏炳栋等，2020；张建城，2017）。因此，温和噬菌体不适合直接用于治疗，因为其可能通过将一种细菌的遗传物质转移到另一种细菌来介导转导，这一过程可能导致抗生素耐药性的发展，甚至可能通过从原细菌中获取基因而增加宿主的毒力（Tan等，2014）。

1.3 噬菌体的增殖机制 烈性噬菌体与细菌的作用可以大致分为吸附、注入核酸、合成、组装、释放这五个阶段。吸附是指噬菌体通过尾部的结合蛋白与细菌细胞表面的受体特异性结合，从而使噬菌体固定在宿主表面 （李振，2018；张建城，2017）。吸附在宿主细胞后，有尾噬菌体通过尾部末端释放的溶菌酶来破坏宿主细胞壁肽聚糖层或特定蛋白，然后其尾鞘结构蛋白伸入细菌细胞内，如同注射器的注射动作，将头部的遗传物质释放到胞内（张建城，2017）。之后，通过利用宿主菌的R NA聚合酶合成噬菌体的mR NA，翻译合成控制宿主细胞的早期蛋白，用于合成后续噬菌体DNA复制所需的酶以及调节蛋白和结构蛋白，随后，以亲代噬菌体核酸为模板，大量复制扩增子代噬菌体所需的核酸（张建城，2017）。在所需的各种蛋白合成后，各蛋白按照一定程序组装成完整的子代噬菌体颗粒，在子代噬菌体达到一定数量后，噬菌体通过内溶素、穿孔素、膜融合蛋白等裂解细菌细胞膜及肽聚糖层，在细胞内压的作用下细菌细胞破裂，从而释放子代噬菌体（许东勤，2018；张建城，2017）。

2 目前主要的噬菌体产品

目前，国内外关于噬菌体的产品主要总结见表 1（魏炳栋等，2020；Zachary 等，2018）。

表1 主要的噬菌体产品

3 噬菌体在畜禽养殖中的应用

3.1 噬菌体在家禽上的应用 禽类养殖是养殖业重要的组成部分，对禽类养殖影响较大的细菌性疾病主要为大肠杆菌病和沙门氏菌病等，感染这些疾病可引起雏鸡大批死亡，成年鸡产蛋率和生产性能下降等。此外，隐性感染的大肠杆菌、沙门氏菌常以蛋、肉为主要媒介，引发人类食源性疾病（魏炳栋等，2020）。目前，已有不少将噬菌体应用于禽类养殖来防控细菌性疾病的研究。卢国民等（2017）研究显示，在20日龄白羽肉鸡饮水中分别添加109PFU/d Bp4和Bp7大肠杆菌噬菌体15 d，可使肉鸡肠道中大肠杆菌和细菌总数显著降低，但不会改变肠道菌群多样性。张灿等（2017）对14日龄白羽肉鸡分别灌服（先连续灌服5 d后间隔3 d，再次灌服5 d）109PFU/d Bp4和Bp7大肠杆菌噬菌体的试验结果表明，灌服噬菌体能够特异性的降低大肠菌群数量，但不影响肠道正常菌群的多样性和结构，同时不影响肉鸡的生长性能。Wang等（2013）在1日龄AA肉鸡日粮中分别添加0.5 g/kg抗生素、0.25 g/kg和 0.5 g/kg噬菌体（108PFU/g），连续饲喂32 d，结果显示，与对照组相比，0.5 g/kg噬菌体的添加显著降低了肉鸡0～14 d的料重比，且与对照组及抗生素组相比，0.5 g/kg噬菌体的添加显著增加了粪便中乳杆菌数量；此外，抗生素和噬菌体的添加均显著减少了粪便中大肠杆菌和沙门氏菌的含量，且对胸肌肉色和pH没有显著影响。刘功成（2016）对1日龄三黄鸡的研究表明，饮水中添加大肠杆菌混合噬菌体（108PFU/mL）0.50 mL/只时，料肉比效果最好，且显著好于氟苯尼考添加组；而添加0.50 mL/只单一大肠杆菌噬菌体（108PFU/mL）的成活率最好，且显著高于氧氟沙星和氟苯尼考组。Kim等（2014）研究表明，1日龄肉仔鸡日粮中添加0.5 g/kg混合噬菌体（108PFU/g）饲喂35 d后，仔鸡料重比及盲肠产气荚膜杆菌C的DNA复制数显著降低。

在蛋鸡上，Lim等（2011）报道，在6周龄蛋鸡日粮中添加106PFU/kg噬菌体饲喂4周，显著降低了蛋鸡口服沙门氏菌攻毒后的死亡率及肝脏、脾脏和盲肠中沙门氏菌含量。Lim等（2012）研究发现，对1日龄蛋鸡用沙门氏菌攻毒后在饲料中分别添加109、107、105PFU/g噬菌体饲喂21 d后， 蛋鸡肠道中沙门氏菌的定植及环境的污染水平均降低，而与未添加噬菌体组相比，107PFU/g和109PFU/g噬菌体的添加组降低量显著。相似的，李梦哲（2014）在沙门氏菌攻毒的蛋鸡基础日粮中添加109PFU/g噬菌体饲喂14 d后发现，显著降低了蛋鸡肠道中沙门氏菌含量 （降低了1个数量级）。Zhao等 （2012）在36周龄蛋鸡日粮中分别添加0.020%、0.035%、0.050%的噬菌体 （108PFU/g）饲喂6周，其结果表明，0.035%和0.050%噬菌体的添加增加了蛋鸡第0～3周的产蛋量，而第4～6周，0.020%、0.035%和0.050%噬菌体的添加均增加了产蛋量，减少了粪便中大肠杆菌及沙门氏菌含量，且对蛋重、蛋壳颜色、蛋壳厚度、蛋壳强度等没有显著影响。Adhikari等（2017）在沙门氏菌攻毒后的40周龄蛋鸡上的试验表明，日粮中分别添加0.1%和0.2%的噬菌体 （108PFU/g）饲喂两周后，0.2%噬菌体的添加减少了攻毒7 d后蛋鸡盲肠中沙门氏菌含量，且使得肝脏和脾脏中沙门氏菌含量分别降低了0.57、0.56 log cfu/g。

以上研究结果表明，肉鸡及蛋鸡日粮中添加或饮水中添加噬菌体（108～109PFU/g）均能降低肠道及粪便中沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌等有害菌群的含量，且对肉品质、蛋品质及产蛋性能、生长性能等没有不利影响，表明适量的噬菌体可作为抗生素替代品用于家禽生产中来防治细菌性疾病。但由于以上试验中鸡只品种、日龄、试验时间及噬菌体添加方式等不同，噬菌体的添加量差异较大（0.2～2 g/kg），因此，最适添加量还需进一步探究。

3.2 噬菌体在猪上的应用 梭状芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等感染往往导致仔猪腹泻、成活率下降、生长受阻甚至死亡。目前已有许多研究发现，噬菌体能够有效减少试验动物体内的大肠埃希菌、梭状芽孢杆菌及沙门氏菌数量，有效降低腹泻感染率与死亡率。Hosseindoust等（2017）在仔猪日粮中添加1.0 g/kg噬菌体（109PFU/g）饲喂35 d，结果表明，噬菌体的添加增加了仔猪8～21 d平均日增重（ADG）及全期重料比（G:F），且增加了仔猪回肠乳杆菌和盲肠双歧杆菌数，并有增加回肠双歧杆菌的趋势；此外，噬菌体的添加还减少了仔猪回肠和盲肠梭状杆菌及回肠大肠杆菌数，且增加了空肠的绒毛高度。与Hosseindoust等研究相似，Kim等（2016）研究也表明，断奶仔猪日粮中分别添加1.0 g/kg和1.5 g/kg噬菌体 （109PFU/g）连续饲喂35 d后，仔猪ADG和22～35 d总肠道干物质表观消化率显著增加，同时回肠乳酸菌数及十二指肠和空肠绒毛高度显著增加，回肠大肠杆菌及梭状芽孢杆菌数降低。Lee等（2017）试验发现，35日龄仔猪日粮中添加107PFU/kg噬菌体饲喂14 d，缓解了肠毒素原性大肠杆菌k88攻毒后仔猪ADG的降低，且显著降低了攻毒后仔猪空肠大肠杆菌黏着评分、血清肿瘤坏死因子α（TNF-a）浓度及结肠内容物pH，增加了回肠绒隐比。Lee等（2016）试验表明，断奶仔猪日粮中添加0.10%噬菌体鸡尾酒（109PFU/g）饲喂35 d，提高了仔猪的ADG和G:F，且噬菌体的添加提高了总肠道干物质表观消化率、粪便总厌氧菌、双歧杆菌、乳杆菌数以及十二指肠和空肠的绒毛高度。Gebru等（2010）研究发现，用鼠伤寒沙门氏菌攻毒后生长猪日粮中添加3×109PFU/kg噬菌体，增加了猪的ADFI、ADG和G:F，降低了攻毒后沙门氏菌脱落分数。Seo等（2018）报道，28 d仔猪日粮中添加5 mL噬菌体鸡尾酒（109PFU/mL）饲喂3周，可降低沙门氏菌攻毒2周后仔猪粪便中沙门氏菌脱落水平及仔猪肠杆菌菌群数，对正常粪便菌群无明显影响。Cha等（2012）在断奶仔猪上的研究表明，仔猪日粮中分别添加0.1%的噬菌体（106PFU/g、108PFU/g）饲喂1周后用肠毒性大肠杆菌（ETEC）攻毒3 d发现，噬菌体的添加使得仔猪对ETEC感染引起的腹泻的抵抗力更强，两组仔猪粪便中ETEC分别下降了约63.92%和60.73%。曾永娣等（2020）研究显示，与抗生素对照组相比，断奶仔猪日粮中添加400 mg/kg和600 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪全期增重及盲肠中乙酸、丁酸和总酸的含量，且仔猪腹泻指数也显著降低；此外，与抗生素对照组相比，400 mg/kg噬菌体的添加能够显著降低仔猪回肠pH，提高十二指肠黏膜蔗糖酶和乳糖酶活性及空肠黏膜麦芽糖酶活性。

在生长猪上，Saez等（2011）在生长猪日粮中添加微囊化噬菌体鸡尾酒（5.0×1011PFU/d）和灌喂60 mL噬菌体鸡尾酒 （5.0×1011PFU）5 d的试验表明，噬菌体的应用降低了猪只攻毒后2 h和4 h脱落的沙门氏菌数及回肠和盲肠中沙门氏菌含量，且日粮中添加噬菌体比灌喂更有效。Yan等（2012）研究表明，生长猪日粮中分别添加0.25、0.5 g/kg噬菌体（108PFU/g）饲喂6周后发现，噬菌体的添加增加了干物质及氮消化率，降低了粪便中沙门氏菌含量，且0.5 g/kg噬菌体的添加增加了粪便中乳杆菌含量，降低了大肠杆菌含量。Kim等（2014）在生长猪日粮中分别添加1.0 g/kg噬菌体鸡尾酒 （109PFU/g）、3.0 g/kg发酵益生菌、1.0 g/kg噬菌体鸡尾酒+3.0 g/kg发酵益生菌进行试验，发现饲喂1.0 g/kg噬菌体及1.0 g/kg噬菌体+3.0 g/kg发酵益生菌饲粮的猪有更高的ADG、ADFI、G:F、总肠道干物质，且粗蛋白质以及总能的表观消化率更高，猪粪便中总厌氧菌、双歧杆菌和乳酸菌数显著增加，梭菌和大肠杆菌数显著减少。同时，Kim等（2014）另一个试验报道，生长猪日粮中分别添加0.5、1.0、1.5 g/kg 噬菌体鸡尾酒（109PFU/g）饲喂 35 d后发现，随着日粮中噬菌体添加量的增加，ADG、ADFI和总肠道干物质表观消化率线性增高，同时，粪便中总厌氧菌、双歧杆菌和乳酸菌数也线性增加，而梭菌和大肠杆菌数线性减少。

以上研究结果表明，仔猪日粮中添加0.4 g/kg及以上的噬菌体，生长猪日粮中添加0.25 g/kg及以上的噬菌体（108～109PFU/g）有促进猪只生长性能和肠道健康的作用。分析其原因为，噬菌体可能通过降低肠道中有害菌群（梭状芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等）的数量，增加有益菌群（乳杆菌、双歧杆菌等）的数量而促进肠道的发育，增加了营养物质的消化吸收能力，进而导致猪只的生长性能提高（Lee 等，2014）。

3.3 噬菌体在反刍动物上的应用 在畜牧养殖中，大肠杆菌O157:H7在反当动物中的流行率要显著高于其他动物，牛已被确认为大肠杆菌O157:H7的主要宿主和传染源，该病菌可通过污染的牛肉及其制品或奶制品进入食物链，造成人群感染（牛冬燕，2009）。 Stanford 等（2010）选用育肥肉牛饲喂1010PFU/头/d噬菌体胶囊或在日粮中添加1011PFU/头/d噬菌体5 d，进行70 d的大肠杆菌检测试验，结果表明，饲喂噬菌体胶囊后可显著缩短大肠杆菌O157:H7攻毒后育肥牛粪便中大肠杆菌O157:H7的脱落期，缩短了14 d。Sheng等（2006）在6月龄肉牛上的研究发现，用大肠杆菌 O157:H7攻毒后饮水中加 1.8×106～5.4×106PFU/mL的噬菌体或直肠给药25 mL 1010PFU/mL 的噬菌体（0、1、2、4 d），结果显示，直肠给药噬菌体比饮水中添加噬菌体显著减少了肉牛粪便中大肠杆菌O157:H7的数量。Rozema等（2009）报道，育肥肉牛口服噬菌体鸡尾酒（3.3×1011PFU/头/d）、直肠给药噬菌体鸡尾酒（1.5×1011PFU/头/d）及口服+直肠给药噬菌体鸡尾酒（4.8×1011PFU/头/d）的试验表明，口服噬菌体鸡尾酒可降低肉牛大肠杆菌O157:H7攻毒后粪便中大肠杆菌O157:H7的阳性率，而与口服组及口服+直肠给药组相比，直肠给药噬菌体鸡尾酒可增加粪便中噬菌体的平均脱落水平。Bicalho等（2012）试验显示，给犊牛口服5 mL 106PFU噬菌体鸡尾酒22 d，可减少犊牛粪便中的大肠杆菌含量，且在整个试验期没有观察到口服噬菌体对犊牛健康的副作用。而Raya等（2011）在绵羊上的试验表明，口服噬菌体鸡尾酒（1011PFU/mL）1周可显著降低绵羊小肠中大肠杆菌O157:H7的含量，减少量大于99.9%。

金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌，可造成乳腺组织结构破坏，牛奶品质下降，严重影响牛奶产量和奶牛健康。李陇平（2011）研究报道，用105PFU/mL噬菌体给泌乳期荷斯坦奶牛在挤奶前后进行乳头药浴2个月后，与洗必太类乳头药浴液相比，噬菌体的使用使得牛乳区发病率和头发病率分别减少了1.97%和3.33%。Gill等（2006）发现，给患有乳腺炎的奶牛连续注射5 d 1.25×1011PFU/mL 的噬菌体（10 mL）后，奶牛乳腺炎治愈率提高了16.7%。

以上研究结果表明，噬菌体可作为抗生素替代品来防治奶牛乳腺炎，且可以降低肉牛及绵羊肠道中大肠杆菌的含量，但由于试验动物品种、日龄、试验期、给药方式等的不同，其在反刍动物上的最适给药量及给药方式等方面的研究还需加深。

4 总结

噬菌体应用于畜禽养殖中对其生长发育无不利影响，且可以防控畜禽细菌性疾病，缓解耐药性的产生。虽然目前噬菌体应用于畜禽养殖生产中尚无统一标准，但已有的研究表明了其在养殖应用中的优势性。因此，扩大噬菌体的宿主谱、安全高效地给药方式、最佳剂量等方面的问题都是今后噬菌体应用于养殖生产中的研究重点。此外，噬菌体的作用机制、噬菌体在动物消化道中的抗菌活性、动物机体自身免疫对噬菌体的影响等方面的研究都需进一步深入。