细胞角蛋白17在不同HPV分型、宫颈病变组织表达及与HR-HPV感染关系

孙 伟 张 芬

湖北省咸宁市第一人民医院 (437000)

宫颈癌是严重威胁女性健康的第四大恶性肿瘤，发病因素较多且呈多步骤、逐渐演变的过程[1]。人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为是宫颈病变的主要危险因素[2-3]。70%有性生活史女性可感染HPV，多数可在8～10个月自愈，但部分患者表现为持续HPV感染状态[4]，导致宫颈病变发生。细胞角蛋白17(CK17)是一种细胞骨架蛋白，在正常组织中表达于复层上皮细胞，在肿瘤组织中则位于腺癌及鳞状细胞癌[5]。有研究显示，CK17表达阳性率与宫颈病变严重程度成正比[6]。由于HPV的致病性和危害程度与其基因结构相关，不同HPV分型宫颈病变预后转归差异较大[7]。因此，本研究探究CK17在不同HPV分型宫颈病变患者中的表达及与高危型HPV(HR HPV)感染关系，分析其在宫颈病变诊治中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2014年1月—2018年12月本院收治的液基细胞学异常者200例为研究对象。纳入标准：液基细胞学检查参照TBS分级系统，不典型鳞状上皮(ASCUS)及以上视为细胞学异常；经病理活检；经HPV病毒检测；行HPV DNA分型检测；年龄>18岁；入组前未行放化疗、免疫治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；妊娠期、哺乳期。200例均为已婚女性，年龄(38.2±6.4)岁(26～47岁)。

1.2 HPV分型检测

采用基因芯片导流杂交技术进行HPV分型检测。专用采样刷取宫颈管内病变部位标本，在保存液内清洗收集组织细胞；取0.5ml细胞保存液离心弃上清，基因组抽提试剂盒(凯普生物技术开发有限公司)提取DNA，取1μl DNA样本作模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增，将HPV PCR反应液、DNA聚合酶和DNA模板按PCR扩增试剂盒(凯普生物技术开发有限公司提供)要求混匀，扩增体系为25μl反应，扩增条件：95℃预变性9min；95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环；72℃再延伸5min，4℃保存；取PCR产物20μl 95℃加热5min，立即冰水浴2min，1ml预热至45℃的杂交液加入杂交孔中，温育2min，每个杂交孔加入0.5ml预热至45℃的杂交液，处理好的DNA样本加在杂交膜上并混匀，温育10min后进行导流杂交(医用核酸分子快速杂交仪安庆生生物科技有限公司，杂交试剂盒深圳亚能生物技术有限公司)，酶标显色后肉眼观察检测结果。

1.3 组织中CK17表达检测

采用免疫组化法检测宫颈病变组织中CK17表达。组织蜡块4μm连续切片，转移至载玻片，60℃ 30～60min烘烤，组织玻片依次二甲苯、无水酒精、梯度酒精脱蜡脱苯水化，3%过氧化氢浸泡10min消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗3次；切片放入EDTA修复液高压锅中加热至沸腾，冷却至室温后，PBS溶液洗涤2次；每张切片滴加5%BSA封闭液，室温放置20min，血清封闭后滴加1:100稀释后的一抗(鼠抗人CK17单克隆抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司生产)，4℃ 过夜；滴加二抗，室温孵育30min，PBS缓冲液冲洗3次；甩干后滴加新鲜配置DAB显色剂显色，显微镜下观察控制反应时间，及时终止显色；自来水冲洗显色后的切片，苏木素复染2min，0.1%盐酸分化，氨水返蓝，梯度酒精水化，二甲苯透明，中性树胶封片后观察。

1.4 结果评估

①HPV分型：有蓝色斑点显现位置判断HPV亚型，1个圆点为单一HPV感染，≥2个为多重感染，其中包括15种HR HPV亚型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)和6种低危HPV(LR HPV)亚型(6、11、41、42、44、CP8304)。②CK17：阳性表达定位于细胞质中，以出现棕黄色或橘黄色颗粒为阳性，根据染色强度分为无着色、浅棕色、棕黄色、棕褐色，分别计分0～3分；根据染色细胞比例分为≤25%、26%～50%、≥51%，分别记为1～3分，染色强度得分与染色细胞比例得分相乘为总分，总分0分为-，1～2分为+，3～4分为++，>4分为+++；将≥++定为阳性表达，<++定为阴性表达[8]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 宫颈病变病理检查结果

200例病理检出宫颈炎48例、宫颈上皮内瘤变(CIN)138例、宫颈癌14例，其中CIN1 54例、CIN2 52例、CIN3 32例。

2.2 不同宫颈病变中HPV感染及分型

200例受检者中HPV阳性169例(84.5%)，单一HPV感染113例(66.9%)、多重HPV感染56例(33.1%)。不同病理分级宫颈病变者HPV阳性率有差异(P<0.05)。HPV分型检测中共检出14个型，其中HR HPV 11个(16、18、31、33、45、51、52、53、58、66、68)，LR HPV3个(6、11、CP8304)，不同宫颈病变中16型均占比最高。见表1、2。

表1 不同宫颈病变中HPV感染率[例(%)]

表2 不同宫颈病变中各分型HPV感染率[例(%)]*

*存在多重HPV感染者，HPV亚型有重复计数

2.3 不同宫颈病变中CK17表达对比

慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中，CK17阳性表达率随病变级别增高而增强(P<0.05)，见表3。

表3 不同宫颈病变中CK17表达对比[例(%)]

2.4 不同HPV分型宫颈病变中CK17表达对比

HPV 16/18、52/58与其他分型病毒在组织中CK17阳性率存在差异(P<0.05)，见表4。各病变组织中CK17表达见图1(见封三)。

2.5 CK17表达与HR HPV的关系

169例HPV阳性宫颈病变患者中HR HPV感染138例、LR HPV感染31例。HR HPV感染者CK17阳性率(57例，41.3%)高于LR HPV感染者(6例，19.4%)(χ2=5.216，P=0.022)。Spearman相关性分析显示，CK17表达与HR HPV正相关(r=0.176，P=0.022)。

表4 不同HPV分型宫颈病变中 CK17表达对比[例(%)]

3 讨论

目前临床根据致癌危险分为LR HPV和HR HPV，LR HPV主要引起上皮细胞良性病变，而HR HPV主要引起宫颈癌等恶性病变[9]。已有研究显示，CK17作为其他癌症标志物，其阳性表达与肿瘤恶性程度相关[10]，但CK17的免疫组化表达与宫颈病变关系仍未明确。有研究显示，CK17在区别CIN及其类似物中没有意义[11]。而Ortiz等[12]学者研究发现，宫颈癌干细胞中CK17表达明显增加，与宫颈组织中的更高致癌性相关。因此，探讨CK17与HR HPV的关系有利于分析CK17在宫颈病变中的作用。但在HR HPV中仍存在部分低级别CIN患者，不同分型的致癌风险也有差异。有报道显示，高级别CIN和宫颈癌患者中最流行的HPV基因型依次为HPV16、52、31等[13]。故本研究还分析CK17在不同HPV分型宫颈病变的表达水平，观察其差异情况，以评估CK17表达水平在HPV感染宫颈病变诊治中的应用价值。

本研究结果显示，200例受检者中HPV阳性率(84.5%)，略高于李玉梅等[14]研究结果，考虑与本研究中宫颈炎患者例数相对较少，CIN和宫颈癌患者占比较高(>75%)有关。对比不同病理分级宫颈病变组织HPV阳性率可发现，CIN2及以上患者HPV阳性率均在90%以上，而慢性宫颈炎及CIN1者HPV阳性率则明显降低。在HPV基因分型中，本研究共检出14个不同HPV基因型，其中HR HPV 11个，在宫颈炎、CIN和宫颈癌各不同宫颈病变种HPV 16型均占比最高。有学者指出，HPV感染情况在我国各个地区不尽相同，但HPV16型在各类人群以及各个地区中感染率均最高[15]，与本研究结论相符。目前普遍认为，HPV16感染与CIN，特别是高度CIN的发生密切相关[16]。但HR HPV中也有其他基因型表现出较高的致瘤危害性，刘植华等学者发现，以CIN2+为重点，根据阳性预测值将各HR HPV基因亚型进行分类，其中HPV33阳性预测值最高为40%，其次是HPV16为29.7%和HPV58为18.2%[17]。本研究中也表现出相似倾向，CIN2者以HPV16型、33型、52型和58型为主；CIN3者以HPV16型、58型为主；宫颈癌者以HPV16型为主。

有研究发现，CK17存在于宫颈储备细胞中，其表达水平随着CIN严重程度的增加而增加，在宫颈癌中总是能检测到CK17，因此CK17在CIN3到宫颈癌的发展中起作用[18]。本研究也显示，慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中，CK17阳性表达随病变级别增高而增强。CK17在宫颈未成熟的鳞状化生细胞的细胞质中均阳性表达，而在鳞状化细胞成熟过程中表达逐渐减弱，CK17作为宫颈干细胞的标记物，能够反映出一种细胞从不成熟向成熟转化的过程[19]。因此，CK17的阳性表达可表现出正常宫颈组织的恶性倾向。本研究结果还显示，HPV16/18中CK17阳性表达率最高、52/58型略低，但均高于其他分型。同时，本研究中HR HPV感染者CK17阳性率也高于LR HPV者，且CK17表达与HR HPV呈相关性较弱的正相关关系。因此，当宫颈病变患者合并16、18、52等HR HPV感染时，会影响正常宫颈干细胞的生长过程，继而影响CK17表达水平，致使其出现更高的恶变风险。有研究报道，CK17敲除会减弱HPV16敲入小鼠肿瘤发生和发展，HPV16感染与宫颈癌细胞系中的CK17表达呈正相关[20]。而另一项研究则发现，在小鼠皮肤中转基因表达高危HPV16 E7癌蛋白会通过增加应激CK17、CK16等表达而出现上皮增生[21]。

综上所述，CK17在高级别宫颈病变中阳性率更高，在HR HPV感染宫颈病变患者中表达增加，且与HR HPV呈正相关关系。