GLP-1类似物的设计及口服制剂研究

张云霄，王 清，刘 宇

(湖南理工学院 化学化工学院，湖南 岳阳 414006)

糖尿病是一种由多种原因引起的血糖失控高出正常水平所造成的全身性代谢性疾病，随着病程发展，会导致多种严重的并发症，可分为I 型和II 型糖尿病.胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要应用于Ⅱ型糖尿病的治疗，它是由空肠L 细胞分泌的功能性短肽与胰岛β 细胞受体相结合，以葡萄糖依赖性的方式促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，改善血糖水平，在治疗中实现患者体重减轻，并且对心脏和内皮起到保护作用[1～3].然而，GLP-1 在人体内半衰期短，易被降解，不能作为药物直接使用.目前针对GLP-1 结构进行的改造，已成功获得多个临床应用的长效GLP-1 类似物.但长效GLP-1 类似物往往采用注射方式给药，患者接受度较差，因此开发口服长效GLP-1 类似物不仅十分重要和必要，而且具有广阔的市场应用前景.

多肽或蛋白质类药物若采用口服给药的方式，绝大多数会被胃肠道系统酶类水解，从而丧失其生理活性[4].另外，多肽类药物由于脂溶性差，很难实现肠道吸收.一般而言，可以从以下两个方面提高多肽类药物的吸收利用度：(1)改变序列中胃肠道系统蛋白水解酶识别的氨基酸酶切位点，通常可以降低多肽类药物被水解的风险；(2)采用非共价修饰传输介质介导技术，例如Emisphere 公司研究开发的SNAC 传输介质介导技术已经成功应用到索马鲁肽、胰岛素、甲状腺降钙素等多种多肽类药物的口服制剂，效果良好[5].石胆酸，又称胆石酸，存在于高等脊椎动物胆汁中，其分子结构中既含有亲水基团，又含有疏水基团，故同时具有亲水性和疏水性，表现出很强的界面活性.本文通过对已经临床应用的利拉鲁肽序列进行胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶酶切位点分析，采用多肽Fmoc 固相合成法制备GLP-1 类似物，通过HPLC 分离纯化与质谱进行鉴定.然后，以上述商业化辅助渗透剂SNAC 为参照，评价设计的GLP-1 类似物经石胆酸孵育处理后，分别在胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶三种蛋白酶存在条件下抵抗降解的能力.

1 实验部分

1.1 试剂

乙腈；DIEA(N，N-二异丙基乙胺)；甲醇；乙醚；DMF(二甲基甲酰胺)；TFA(三氟乙酸)；苯甲醚；苯甲硫醚；EDT(1，2-巯基乙烷)；DCM(二氯甲烷)；MBHA 树脂；HATU；HoBt；Fmoc-AA-OH；Pal-Glu(OSu)-OtBu；Fmoc-Lys(Dde)-OH；茚三酮；SNAC；碳酸氢铵；胃蛋白酶；糜蛋白酶；胰蛋白酶.

1.2 主要仪器和设备

小型低温高速离心机；台式高速大容量冷冻离心机；液相色谱仪；低温冷冻干燥机；生物摇床；电子分析天平；循环水式多用真空泵；超低温保存箱；层析管；色谱柱；pH 计.

1.3 实验方法

1.3.1 GLP-1 类似物的设计

前期已有研究[5，6]报道了维持GLP-1 结构与功能的关键氨基酸残基，丙氨酸扫描实验表明His7，Gly10，Phe12，Thr13，Asp15，Tyr19，Gly22，Phe28，Ile29，Trp31 和Leu32 是维持其空间结构稳定和生理功能执行的关键残基，本文以此为基础对GLP-1 进行设计.

利用生物信息学技术对GLP-1 进行蛋白酶酶切位点预测分析，发现GLP-1 序列中存在7 个胃蛋白酶酶切位点，分别位于其序列的第11、12、19、20、27、31 和32 位氨基酸残基；存在3 个胰蛋白酶酶切位点，分别位于其序列的第26、34 和36 位氨基酸残基；存在4 个糜蛋白酶酶切位点，分别位于第 12、19、28 和31 位氨基酸残基.由此确定了在GLP-1 序列的C 端可以突变的氨基酸有Glu27、Ala30、Val33、Lys34以及Gly35.

本文设计策略为：将Ala8 突变成氨基异丁酸(aminoisobutyric acid，Aib)，命名为类似物1；将Ala8 突变成Aib，并将第30、34 位氨基酸残基突变成谷氨酸，命名为类似物2；将第Ala8 突变成Aib，并将第30、33、34、35 位氨基酸残基突变成谷氨酸，命名为类似物3.GLP-1 类似物序列设计如图1所示.

图1 GLP-1 类似物序列设计

1.3.2 GLP-1 类似物的合成

采用Fmoc 固相合成制备GLP-1 类似物，进行MBHA(0.1 mmol/0.31 mmol/g)树脂的膨化与去保护，称取相应氨基酸、HATU 和HoBt 进行氨基酸活化，偶联反应1～2 h，2%水合肼去掉Dde 基团，用裂解试剂(TFA ∶ EDT∶苯甲醚∶苯甲硫醚=90∶2∶3∶5)进行裂解，加入6 倍量的冰乙醚沉淀，离心，样品冻干.

1.3.3 HPLC 纯化

称取50 mg 样品用10 mL 溶解液(水∶醋酸∶DMF∶乙腈=4∶2∶2∶2)溶解.流动相A 为含0.1%TFA的超纯水，流动相B 为含0.1%TFA 的乙腈，流速为2 mL/min，乙腈梯度变化：0～15 min，40%～70%；15～28 min，70%～90%；28～30 min，90%～40%，质谱鉴定收集目的峰，真空冷冻干燥.

1.3.4 质谱鉴定

将 CCA 粉末溶于 50% 乙腈(含 0.1% TFA)中，配制成过饱和溶液.震荡混合助溶 CCA，12000 rpm，离心 5 min，取上清备用.先取 0.5 µL 待测样品至点样板上，干燥后再取 0.5 µL CCA 溶液均匀覆盖待测样品，待自然风干后进行质谱测定.

1.3.5 蛋白酶水解

分别称取4 mg 上述冻干的类似物，用10 mL 100 mM 碳酸氢钠(pH7.5)溶解，每管500 μL.实验分为阳性对照组、阴性对照组和实验组，其中不加酶和辅助剂的样品管作为阳性对照，加酶但不加辅助剂的样品管作为阴性对照，实验组则分别加入10 mM石胆酸和100 mM SNAC，同时按照类似物∶酶=100∶1比例分别加入胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶.其中胃蛋白酶为pH1.5 的水溶液，其他操作一致.混合均匀后放置在37 ℃孵育，分别在2、4、6、12 和24 h 取样[5]，取样后煮沸5～10 min 终止水解反应.

1.3.6 石胆酸浓度优化

分别加入2、4、6 和8 mM 石胆酸至类似物1 中，探讨加入不同浓度石胆酸抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶水解作用，操作方法同蛋白酶水解实验.

2 结果与讨论

2.1 GLP-1 类似物合成

样品制备利用多肽Fmoc 固相合成法获得了利拉鲁肽和3 个新型GLP-1 类似物，HPLC 分离纯化，经MALDI-TOF 质谱鉴定利拉鲁肽、类似物1、类似物2 和类似物3 的分子量分别为3747.9490 Da、3763.9690 Da、3793.3037 Da 和3895.0518 Da，实际分子量与理论分子量一致，这表明通过Fmoc 固相合成法成功地制备了利拉鲁肽和3 个新型GLP-1 类似物，色谱及质谱结果如图2所示.

图2 利拉鲁肽HPLC 和质谱图

2.2 蛋白酶水解

利拉鲁肽的阳性对照组在37 ℃保温24 h 仍然稳定存在.糜蛋白酶水解利拉鲁肽，在100 mM SNAC存在下，水解2 h，利拉鲁肽降解完全；而在10 mM 石胆酸存在下，水解24 h，仍有部分利拉鲁肽存在.胰蛋白酶水解利拉鲁肽结果与糜蛋白酶水解结果相近(数据未展示)，这些结果表明，相比于SNAC，石胆酸可以更好地保护利拉鲁肽抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解作用(图3).

图3 糜蛋白酶水解利拉鲁肽的质谱结果

类似物1 在100 mM SNAC 存在下，经糜蛋白酶水解2 h 后几乎降解完全，而在10 mM 石胆酸存在下，经糜蛋白酶水解24 h 还有大部分存在.这些结果表明，相比于SNAC，石胆酸可以更好地保护类似物1 抵抗糜蛋白酶的水解作用(图4).

图4 糜蛋白酶水解类似物1 的质谱结果

类似物1 在100 mM SNAC 存在下，经胰蛋白酶水解2 h 仅有少部分存在，而在10 mM 石胆酸存在下，经胰蛋白酶水解24 h 还有大部分存在.这些结果表明，相比于SNAC，石胆酸可以更好地保护类似物1 抵抗胰蛋白酶的水解作用(图5).

图5 胰蛋白酶水解类似物1 的质谱结果

类似物2 在100 mM SNAC 中经糜蛋白酶水解2 h 降解完全，而在10 mM 石胆酸中经糜蛋白酶水解6 h 还有部分存在，12 h 后才降解完全.这些结果表明，相比于SNAC，石胆酸可以更好地保护类似物2 抵抗糜蛋白酶的水解作用(图6).类似物2 在100 mM SNAC 中经胰蛋白酶水解2 h 降解完全，而在10 mM 石胆酸中经胰蛋白酶水解2 h 只有少部分存在，表明石胆酸抵抗胰蛋白酶水解类似物2 的作用相比SNAC 只有微弱的优势.

图6 糜蛋白酶水解类似物2 的质谱结果

类似物3 在100 mM SNAC 中经胰蛋白酶水解2 h 仅剩少部分，而在10 mM 石胆酸中经胰蛋白酶水解24 h 仍有部分存在.这些结果表明，相比于SNAC，石胆酸可以更好地保护类似物3 抵抗胰蛋白酶的水解作用(图7).类似物3 在100 mM SNAC 存在下经糜蛋白酶水解2 h 降解完全，而在10 mM 石胆酸中经糜蛋白酶水解6 h 还有少部分存在，12 h 后才降解完全.这些结果表明，相比于SNAC，石胆酸可以更好地保护类似物3 抵抗糜蛋白酶的水解作用.

图7 胰蛋白酶水解类似物3 的质谱结果

利拉鲁肽、类似物1、类似物2 和类似物3 分别加10 mM 石胆酸和100 mM SNAC，在胃蛋白酶下均降解完全，表明石胆酸和SNAC 均不能抵抗胃蛋白酶水解利拉鲁肽的作用.

2.3 石胆酸浓度优化

类似物1在石胆酸存在下表现出最优的抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用，因此选用类似物1探索石胆酸的最佳浓度.类似物1 中加入2 mM 石胆酸时，经糜蛋白酶水解2 h 完全降解，而加入的石胆酸浓度为4、6、8 mM 时，水解24 h 仍稳定存在(图8).而经同样处理，类似物1 中加入的石胆酸浓度为2、4、6、8 mM 时，在胰蛋白酶中水解24 h 后仍稳定存在.因此，石胆酸最佳浓度为4 mM.

图8 糜蛋白酶水解经不同浓度石胆酸处理的类似物1 质谱结果

3 结论

本文设计了3 个新型GLP-1 类似物，并探讨了石胆酸作为渗透辅助剂抵抗胃肠道酶类水解的效果.结果表明，相比于SNAC，石胆酸在抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用时表现出更优异的效果；10 m 石胆酸抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用效果最优的是类似物1，其次分别是利拉鲁肽和类似物3，类似物2 效果最差；石胆酸的最佳作用浓度为4 mM.石胆酸虽不能抵抗胃蛋白酶的水解作用，但有望制成肠溶制剂实现多肽类药物的口服给药.