病原微生物与阿尔茨海默病相关性研究进展

海吉涛 罗焕敏，2

1 暨南大学基础医学院药理系，广州，510632，中国

2 暨南大学脑科学研究所，广州，510632，中国

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种严重的中枢神经系统（central nervous system，CNS）退行性疾病，临床表现以记忆和认知障碍为主，影响到全世界5 000 多万人，发病率还在持续攀升［1］。典型的组织病理学特征是镜下可见由40～42 个氨基酸组成的β淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）沉积形成的老年斑（age pigment，SP）和Tau 蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）［2］。Aβ是由β-分泌酶和γ-分泌酶降解β淀粉样前体蛋白（amyloid precurso protein，APP）形成的。这些病理改变主要集中在大脑皮质、海马以及前脑等。此外，AD 的其他特征还包括突触和神经元丢失，小胶质细胞增生，平野小体（hirano body）产生［3］等。NFTs 和Aβ并非AD 所特有，在其他神经性疾病也会产生。

三十年前，“感染假说”已被提出，但很少受到大家的关注。然而，最近已经证明，Aβ是一种抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP），可作用于病毒、细菌和真菌，这使AD 病因学的“感染假说”又重新回到了人们的视野中。据报道，AD 与多种病原微生物，包括肺炎衣原体、螺旋体、幽门螺杆菌、牙龈卟啉单胞菌、真菌、单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus type Ⅰ，HSV-1）以及巨细胞病毒之间存在着显著的相关性。病原体感染会增加Aβ沉积，继而引起小胶质细胞激活、增殖，释放促炎细胞因子白细胞介素-1（interleukin，IL-1），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，导致神经元损伤、凋亡。许多假说已经证明了累积性感染与AD 的关系，从而揭示了神经炎症和神经感染在AD 发病中的作用［4-5］。本文将要探讨几种病原体感染对AD的发生和发展的作用。

1 细菌与AD 发病关系

1.1 肺炎衣原体与AD

肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，Cpn）是一种专性的细胞内革兰氏阴性菌，也是一种呼吸道病原体，其生命周期比较复杂［6］，主要有原体和始体两种主要生存形式。代谢惰性，但具有传染性的原体进入宿主细胞后，遂分化为代谢活跃、但非传染性的始体。始体通过从宿主细胞获得的营养物质而进行二分裂形式繁殖大量的原体［7-8］。

最近的研究结果表明，Cpn 感染与CNS 退行性疾病有着密切的关系。Balin［9］等首次通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）分析发现，实验组AD患者的脑组织呈现Cpn 阳性率为90%，而对照组阳性率仅为5%；阳性脑组织样本由免疫组织化学技术和电子显微镜检查表明，Cpn 抗原存在于颞叶皮层、海马、顶叶皮层、前额叶皮层；肺炎衣原体可感染小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元及脑血管外周细胞；在脑细胞内，可抵抗溶酶体融合和免疫识别。通过免疫标记显示被Cpn 感染的这些细胞主要集中在与AD 相关的神经病理区域［10］。在一项研究中，Hammond 的实验结果显示肺炎衣原体抗原在神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞和周细胞内均呈反应阳性；在AD 脑额叶和颞叶皮层胞外，均有多种肺炎衣原体特异性抗体。进一步的免疫标记提示AD 大脑的同一区域存在肺炎衣原体、淀粉样蛋白沉积和NFTs［11］。这些研究进一步表明Cpn 感染与AD 的发病有关。与此同时，关于肺炎衣原体，有证据表明它通过嗅神经进入CNS［12］；同样，Cpn 感染呼吸道黏膜后在感染的单核细胞内伴随淋巴和血行扩散，直至穿过血脑屏障进入脑内，并且它免疫逃避小胶质细胞的氧化应激和杀菌的机制。

1.2 螺旋体与AD

螺旋体（spirochetes）是一种具有内鞭毛的螺旋状的革兰氏阴性细菌，也是最具神经嗜性的病原体，可以入侵CNS 并引起潜在的、持续的感染［13-14］。螺旋体可通过三叉神经进入脑部。事实上，螺旋体感染后会引起严重的大脑形态和功能紊乱，如脑血管病变、脑灌注不足和毛细血管网紊乱［15］。已发现这些均与AD 发病有关，并作为导致痴呆的病原体而备受关注。Miklossy通过14 例AD 病人尸检的组织病理学结果证实了，可在脑脊液、大脑皮层和血液中发现螺旋体的存在，而在匹配的对照组13 例中没有观察到螺旋体［16］。此外，有学者发现，由于螺旋体能够形成生物膜，可以抵抗有害环境和逃避宿主免疫反应，而引起慢性感染和炎症反应，导致进行性痴呆形成，以及皮质萎缩、淀粉样蛋白沉积和小胶质细胞增生［17］。随后，该团队［18］从3 个AD 患者的死后大脑中成功培养出伯氏疏螺旋体，并且这些伯氏疏螺旋体与SP 和NFTs 位置重叠。该团队［19］还通过在神经胶质细胞和器官型培养物（organotypic cultures）中注射螺旋体，发现能够产生AD 病理学特征，其实验结果更加证实了螺旋体与AD 的相关性。Riviere［20］等通过PCR 和单克隆抗体技术对34 例受试者的大脑分析显示，14/16 AD 和4/18 非AD 供体中有螺旋体，说明了AD 脑内有较多的螺旋体。此外，PCR还从3 例AD 和2 例对照供体中检测到三叉神经节中有螺旋体，表明螺旋体可能通过三叉神经的分支感染大脑，进一步证明螺旋体感染与AD 可能存在因果关系。有学者［21］根据Koch 和Hill 的标准，对AD 病人大脑中关于螺旋体的数据进行统计分析，也发现螺旋体感染与AD 之间有因果关系。

1.3 幽门螺旋杆菌与AD

Marshall 和Warren 首次描述了幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori，Hp）从胃黏膜活检组织中成功分离的过程［22］。Hp 是一种寄生在胃黏膜的螺旋状、微需氧、弯曲形的革兰氏阴性细菌。它感染了全世界大约有一半以上的人口，其中主要影响老年人［23］。大量的临床研究表明，Hp 不仅会导致胃溃疡和胃癌的发生，还与多种非胃肠道疾病如动脉粥样硬化、高血压、AD 等密切相关。Hp 可通过口腔—鼻腔—嗅觉神经途径进入CNS 或通过循环中的单核细胞经由破坏的血脑屏障进入脑内，也可能经过胃肠道到大脑的快速逆行神经通路进入CNS，导致中枢神经退行性病变。许多流行病学证实，Hp 感染与AD 的发生有关。有研究表明，与对照组相比，AD患者Hp 感染率有所增加［24］。一项以人群为基础的队列研究发现，Hp 感染与患AD 的风险增加有关。Beydoun 等人［25］也在一项大型回顾性队列研究中发现，Hp 血清阳性与AD 发病率直接相关。此外，Kountouras 等［26］报道，对50 例诊断为AD 的患者用精神状态检查表（mini-mental state examination，MMSE）、剑桥老年认知考试（cambridge age cognition examination，CAMCOG）和痴呆功能等级测定（FRSSD）来评定AD 的病情程度，同时以内窥镜下胃黏膜活检、快速尿素酶试验（rapid urease test，RUT）、酶联免疫吸附试验和血清Hp-IgG 抗体阳性作为诊断胃Hp 感染标准，发现AD 患者胃部Hp 阳性率达88%，而对照组仅为46%。并且，对阳性患者进行Hp 根除治疗两年后，AD 患者认知功能得到明显改善。提示Hp 感染参与了AD 的发生，而根除Hp 对AD 的临床治疗产生了积极影响。Chang 等［27］为了探讨Hp 根除治疗对AD 的影响，用8 年共招募了3 万多例同时患有AD 和消化性溃疡的患者，结果显示，与未根除Hp 或根除Hp 失败的AD患者相比，根除成功的患者AD 进展减缓，风险降低〔优势比（OR）95% CI：0.35（0.23～0.52）〕，故认为Hp 根除治疗可延缓AD 的进展。虽然以上研究支持Hp 感染对AD 的发生有重要的影响，但日本AD 研究所对大约900 个AD 病例进行的长达6 年的追踪观察，发现Hp 感染和AD 并没有相关性［28］。因此，Hp 感染与AD发生的关系还需要大量细致的研究来证实。

1.4 牙龈卟啉单胞菌与AD

牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）是一种革兰氏阴性厌氧球杆菌，产生牙龈素（gingipains）为主要的毒性因子，后者是由赖氨酸-牙龈素（lysinegingipain，Kgp）、精氨酸-牙龈素A（arginine-gingipains A，RgpA）和精氨酸-牙龈素B（RgpB）组成的半胱氨酸蛋白酶［29］。Pg 也是牙周炎的主要病原体之一，它能够逃避宿主的免疫监控而存活和生长，并建立和维持炎症毒性的环境［30］。最近许多研究表明，Pg 与AD 有一定关系。Dominy 等［31］发现，AD 患者的脑内不仅存在Pg，也存在牙龈蛋白酶（gingipains），后者的表达水平与tau 蛋白相关。他们还证实，牙龈蛋白酶抑制剂能有效降低小鼠大脑中的Pg 负荷，阻断Aβ1-42的产生，减少了神经炎症，并能拯救海马神经元。Ilievski 等［32］给10 只野生型小鼠口服Pg 诱导慢性牙周炎，通过免疫荧光显微镜、共聚焦显微镜和定量PCR 检测到实验组Pg/牙龈蛋白酶的存在，同时发现实验组小鼠出现神经炎症、神经退行性变、小胶质细胞增生、星形胶质细胞增生、细胞内外淀粉样斑块积累和NFTs 形成，而对照组则并没有。该实验结果表明，慢性牙周炎病原体可导致与AD 一致的神经病理学形态。Ding 等［33］通过Morris 水迷宫法、聚合酶链反应、酶联免疫吸附测定和免疫组织化学技术对15 只感染Pg 的小鼠分析，发现实验组TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎细胞因子表达水平明显升高，且认知功能显著下降。组织蛋白酶B（cathepsin B，Cat B）是一种半胱氨酸溶酶体蛋白酶，具有β分泌酶活性，参与APP 的加工与形成。Nie 等［34］发现，慢性全身暴露于牙龈卟啉单胞菌脂多糖，后者可通过激活单核细胞/巨噬细胞CatB/NF-KB 信号，诱导成年小鼠大脑Aβ积累，进而促使AD 形成。因此，CatB 可能是一个AD 治疗的新靶点。

2 真菌与AD

最近报道AD 发病可能与真菌感染有关，真菌成分可以在AD 患者死后的脑组织中找到，而在对照组脑组织中却未发现。Pisa等人［35］利用几种真菌的特异性抗体，在AD 脑细胞内和细胞外检测到真菌物质，还对AD 患者不同脑区如，外额叶皮层、小脑半球、内嗅皮层/海马体和脉络丛进行检测分析，发现这些脑区均含有真菌物质，而在正常个体的脑组织中则没有发现，证实了AD 患者的CNS 存在真菌感染。该团队还对AD 患者血清进行了大量检测，结果表明AD 患者血样本中检测到了真菌，因此认为播散性真菌感染可能是AD 的危险因素［36］。并且，两项研究均发现在脑血管中存在真菌结构。真菌感染可引起血管病变，而大多数AD 患者的CNS 系统中也表现出血管损伤，并有高达90%的AD 患者出现各种脑血管病变。因此真菌感染导致的血管病变与AD 患者CNS 系统的血管损伤是否存在联系，仍需进一步验证。

Alonso 等［37］通过蛋白质组学分析、PCR 分析和DNA 测序技术发现AD 患者脑内存在真菌感染。随后，他们利用免疫组化技术和一代测序（next-generation sequencing，NGS）发现AD 患者感染的常见真菌属有：交替菌属（alternaria）、念珠菌属（candida）和马拉色菌属（malassezia）等［38］。此外，Pisa 使用针对真菌抗原的特异性抗体从AD 患者大脑切片中检测到真菌相关蛋白：烯醇化酶、b-微管蛋白以及多糖几丁质。其中，多糖几丁质也是AD 淀粉样斑块和淀粉样血管病的重要组成部分，这一点可以通过AD斑块的区域荧光染色证实［39］。以上实验结果均证实AD 患者脑内受到真菌感染。

3 病毒与AD 发病关系

3.1 单纯疱疹病毒Ⅰ型与AD

单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus type Ⅰ，HSV-1）是一双链DNA 包膜病毒，属于疱疹病毒科的一员，外周由一个二十面体形的核衣壳包裹着。在病毒包膜和衣壳之间，有一层由26 种病毒蛋白组成的被膜，这些蛋白是HSV 生命周期所必需的成分［40］。该病毒具有亲嗜神经组织性，在人群中普遍流行。据统计，在不同国家或地区的50 岁及以上人群中HSV-1 感染率达80%～95%，一旦被感染，将会伴随终生。关于AD 的发生，有一种假说即衰老、压力、免疫抑制、外周感染或免疫系统衰退，导致潜伏于三叉神经节的HSV-1 重新被激活，HSV-1 通过氧化应激或直接侵袭，导致Aβ累积和Tau 过度磷酸化，最终形成SP 和NFTs；此外，脑内的病毒也可能受APOEε4 等位基因的影响，加重其激发程度［41］。研究人员注意到，在疾病的早期，AD 脑组织损伤的区域也是HSV-1 引起脑炎症的区域［42］。最近，有学者用ELISA 技术对101 例AD 患者及与之匹配的107 例正常老年人进行了HSV-1 抗体测定，结果显示AD 组HSV-1 抗体阳性率为79.2%，而对照组仅为58.0%，差异有统计学意义，因而证实了HSV-1 感染与AD 发生之间的关系［43］。此外，一项研究表明，HSV1-DNA 存在于AD 老年斑中。另有学者研究了7 个相互独立的组，在AD 大脑组检测到HSV-1 的比率高于对照组，并且在AD 大脑组，HSV-1-DNA 与淀粉样斑块有非常强的共定位性，而在正常大脑组没有发现此种现象［44］。以上充分说明了HSV-1 与AD 发病有关。

此外，与青年人相比，HSV-1 基因在老年人大脑出现频率较高。可能是由于随着年龄的增长，免疫系统功能的下降，血脑屏障的通透性增加，因此病毒基因在老年人时更容易进入大脑。一般将抗IgM 作为HSV 再活化的标志，抗IgG 作为既往感染的标志。开展全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）对AD 患者血清抗HSV-1 IgG 和IgM 抗体进行流行病学调查，或对传染性疾病流行病学调查的负荷和IgG亲和力指数的测量［45］，结果证实了IgG 的存在表明感染了HSV-1，而IgM 的发现则表明HSV-1 重新激活。Letenneur 等人对500 多例AD 患者进行为期14 年的随访，发现血清抗HSV-1 IgG 和IgM 抗体的存在会增加AD 发生的危险性［41］。Lovheim 等［46］对一项有3 000 多名参与者参加的前瞻性研究表明，抗HSV-1 IgM 反应阳性几乎使AD 风险增加两倍。以上证据，支持HSV-1 感染与AD 发病有密切关系。

3.2 巨细胞病毒与AD

巨细胞病毒（cytomegaovirus，CMV）是一种β疱疹DNA 病毒，也被称为细胞包涵体病毒。在人群中CMV 血清阳性率为20%～100%［47］。该病毒存在于骨髓细胞室（myeloid cell compartment）中，也潜伏在单核细胞中，对许多细胞类型具有嗜性，如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经元等［48］。CMV 可引起消化系统、泌尿生殖系统和神经系统及其他系统感染，从轻微无症状性感染到可危及生命的严重感染。CMV 感染后可以在人体终生潜伏或呈低活性持久存在状态，对于大多数免疫力正常的人来说，即使感染了CMV 也只有无症状或轻微症状。然而，与HSV-1 一样，CMV 也可能在应激状况下或其他条件刺激下重新被激活。Carbone 等［49］对一组老年人随访了5 年，发现AD患者CMV 抗原的IgG 水平显著高于对照组。Barnes等人［50］对849 名受试者也进行了随访，发现在5 年的随访期中，CMV 血清阳性者发生AD 的风险增加2 倍，且认知能力下降迅速。Lurain 等［47］通过分析AD 患者的脑脊液、血清及淋巴细胞冻存液，证明了血清CMV特异性IgG 抗体水平与NFTs 有关；脑脊液IFN-γ也在CMV 血清阳性者中检测到，且与NFTs 显著相关，也证实了CMV 与AD 病理特征之间的直接和间接联系。因此，以上这些研究支持了CMV 和AD 的发生发展之间的关联。

4 结语

综上所述，AD 患者的大脑中存在多种病原微生物，从细菌到病毒再到真菌，它们无论是直接透过血脑屏障，或是引起炎症反应进而感染脑组织，亦或是其残骸对神经系统造成损害，都对AD 这一神经退行性疾病产生了重要影响。因此病原微生物在AD 发展过程中的作用不可忽视。

随着世界人口老年化加剧，AD 患病率也在逐年攀升。近年来，AD 的“感染假说”越来越受到人们的广泛关注。许多学者已开展病原体感染和AD发病之间相关性的研究，取得不少重要的成果，但现有的实验证据仍显不足，确定两者之间真正关系还有许多工作要做。例如，需要进一步阐明这些病原微生物侵入脑内的详细机制，哪种微生物引发AD 最常见？机制是什么？侵入脑内的微生物或其残骸要达到多少量才发病？这些侵入物是一次性进入还是多次反复或持续进入？哪些脑区先受到影响等？只有这样才能为日后研发出更加有效的临床预防和治疗AD 的新方法提供准确的可资参考的信息。