视网膜色素上皮细胞来源外泌体与老年性黄斑病变

张思琪 张元元

河北北方学院，张家口，075000，中国

老年性黄斑病变（age-related macular degeneration，AMD）作为一种与年龄有关的致盲性退行性眼底疾病，近年来成为中老年最为常见的眼部疾病，成为世界范围内导致视力严重下降和不可逆丧失的重要原因。根据其临床上的表现将AMD 分为两个类型：一种是干性（萎缩型/非新生血管性）AMD，在AMD 病症中更为多见，约占患者总数的85%～90%，迄今为止缺乏有效的治疗方法。临床上以玻璃膜疣、地图样萎缩和光感受器变性为干性AMD 的典型症状；另一种是湿性（渗出型/ 新生血管性）AMD，湿性AMD 的患者通常会有较干性AMD 患者更严重的常规视力损伤，且干性AMD 有极大的几率能够向湿性AMD 发展转化。湿性AMD 常与异常的脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）有关，现有治疗湿性AMD 的手段也多有其局限性。目前大多数学者认为，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞数量的衰减与死亡是引起AMD 的主要病理改变因素之一。RPE 细胞起源于神经外胚层，是视网膜结构的最外层，对眼睛的发育和视网膜疾病发挥起着至关重要的作用。根据最新的研究发现，RPE 细胞分泌的外泌体可能参与AMD 的发病与发展。在AMD 的病情发展过程中，玻璃膜疣的形成可能会受到相关蛋白（例如RPE细胞外泌体释放的结晶性αB 蛋白）数量增加的影响。同时，氧化应激状态下的RPE 细胞可能通过其外泌体蛋白的自分泌途径直接影响RPE 细胞的存活与凋亡从而参与AMD 病程。对于AMD 形成具有举足轻重影响的CNV 的生成可能也有RPE 细胞外泌体的参与。此外，RPE 细胞外泌体在AMD 形成过程中的补体激活途径等方面也可能产生了明显影响。随着眼科领域对RPE 细胞外泌体的深入研究，为防止RPE 细胞损伤提供了更新的思路和途径，为AMD 的医疗保健方面带来了越来越多的新可能性。

1 老年性黄斑病变的原因及病理

到目前为止，即便国内外研究学者对AMD 进行了大量研究，但由于人体生理反应机制与病情的复杂，其确切的发病机制仍未被探索出。可能与光照等外界环境因素有关，可能与营养因素有关，可能与吸烟、饮酒、中毒等个人因素有关，也可能是全身性疾病如免疫系统紊乱、呼吸系统及心血管系统的衰退等所引起，或者可能是多个因素通过复杂的交叉复合作用引发［1］。干性AMD 临床上以玻璃疣、地图样萎缩和光感受器变性为典型症状，在疾病的早期阶段，患者经常出现轻度或中度视力下降、视物模糊以及阅读困难。由于病情的持续恶化，患者的视力损伤也会不断加重，并伴随着出现诸如绝对中心出现暗点、中心视力减退等症状；湿性AMD 常与异常的CNV 有关，其视功能严重损伤的病理学基础即黄斑区CNV 的形成。科学研究［2］表明，引起AMD 的主要病理变化可能是RPE 细胞的影响作用，RPE 细胞的凋亡导致了RPE 细胞代谢功能下降：RPE细胞对视细胞外节盘膜吞噬的消化代谢功能衰退，大量的外节盘膜无法完全被吞噬，导致未能被正常代谢的盘膜小体滞留，基底细胞原生质容纳负荷，通过胞吐作用将盘膜体残留从细胞中排出，保证细胞正常运作。其中一种情况是被排出的代谢废物沉积于Bruch 膜，或致大量外节盘膜残余小体堆砌黏连成团，形成玻璃膜疣。玻璃膜疣的存在发挥了阻断效果，致使细胞机能下降，黄斑区无法行使正常功能，最后引发一系列的继发性病理病变。另一种情况由于盘膜残余小体的积聚，使无法负担的Bruch 膜受到损伤，脉络膜毛细血管可以穿透Bruch 膜损伤部位，通过裂口轻而易举地到达眼底其他位置，经过细胞分裂在RPE 细胞下及视网膜神经上皮下，脉络膜毛细血管增殖扩张，形成CNV。CNV 壁结构异常并随着其逐渐扩大、渗漏和破裂出血，继而形成瘢痕或黄斑水致，致使黄斑区受到严重破坏，造成中心视力下降，严重则视力完全丧失。而“兰光损害”、细胞微环境氧自由基的富集、微量元素锌的浓度等多方面因素都影响着RPE 细胞的生存与凋亡。异常状态下的RPE 细胞外泌体携带的分泌蛋白也可能参与补体途径、激活免疫调节与应激反应，破坏视细胞生存的微环境的平衡，造成AMD。

2 外泌体的生理特性

外泌体是特指直径约30～150 nm 的盘状囊泡，人们对它的认识是开始于绵羊体外培养的网织红细胞即尚未成熟的红细胞上清液中［3］。此后发现，细胞内溶酶体微粒内陷的生成物是外泌体的来源，这种盘状囊泡可以与细胞发挥膜融合作用，分泌到细胞膜外包括外周血、胸腔积液、尿液、唾液、精液等多种体液中。因磷脂酰丝氨酸交联聚集在外泌体表面，使得外泌体能在体液中稳定存在［4］。外泌体来源多种多样，可来自各种类型细胞，造血细胞、内皮细胞、间质细胞、B 淋巴细胞、肿瘤细胞等各种活细胞均可分泌外泌体。外泌体研究的初始阶段被认为只是细胞的正常生理病理代谢的产物，但目前已经有大量证据表明，外泌体不仅是细胞正常生理病理代谢产物，它是具有特异性分泌功能的多囊泡体，是细胞外环境的信号转导的重要媒介，参与细胞间通讯，在细胞的微环境中承担着非常重要的职责。外泌体表面富含具有生物活性的脂类，神经酰胺、神经鞘磷脂、胆固醇等这些脂类物质可作为脂质相关疾病的生物指标；外泌体可携带多种RNA，如mRNA、microRNA（miRNA）和长段非编码RNA（long non code RNA，IncRNA）等生物信息［5］，这些信息可以直接传递遗传信息，外泌体通过这种方式直接控制细胞或调节细胞机能；由于外泌体起源于内涵体，因此其中含有Tsg101 和Ailx 两种特征性蛋白，除此之外，外泌体中还高度富集着四跨膜蛋白超家族（包括CD3、CD37、CD63、CD81 等外泌体特征性蛋白）、融合蛋白、运输蛋白（主要是脂筏标记蛋白可膜联蛋白）、热休克蛋白等丰富的具有生物活性的蛋白质，各种活性蛋白分子复合作用，为外泌体提供了物质基础，以参与细胞间的信息交流。由于外泌体的功能及其分子的组成取决于不同的细胞来源，因此来自不同类型细胞的外泌体效应不同。

3 RPE 细胞外泌体与AMD

RPE 细胞来源于神经视网膜结构的最外层即色素上皮层，是单层的六面柱状细胞，排列整齐规则，细胞质内除了细胞核、脂褐质以外还有溶酶体、吞噬体等细胞器支持细胞运作。RPE 细胞基底部紧邻Bruch 膜，构成RPE 细胞-Bruch-脉络膜毛细血管复合体（血-视网膜屏障）。RPE 细胞位于视网膜光感受器细胞外节和脉络膜之间，是重要的转运通路。此有选择性的离子通道被称为RPE 细胞的“清道夫机能”，RPE 细胞一方面可以防止离子、水、营养物质以外的物质进入视网膜，另一方面将代谢终产物排出脉络膜，在视觉功能中具有不可或缺的作用。除此之外，RPE 细胞可以保证Bruch 膜的完整性，尿激酶会对Bruch 膜造成侵蚀，RPE 细胞可以分泌抵抗这种酶活性的物质，以达到保护Bruch 膜不被破坏的作用；RPE 细胞可以通过分泌特异性活性物质，来抑制血管内壁的新生，破坏新生血管内壁与其他血管壁的接口，使已生成的新生血管萎缩，并抑制新生血管的生成，形成阻断CNV 生成的生化屏障；RPE 细胞能够维持光感受器的更新，通过吸收特定频率的光线，减少对眼睛有损伤的光线在眼内的散射，能够维持眼内自由基的数量，使氧化程度处于动态平衡，保护眼内组织免受氧化损伤；RPE 细胞亦可通过转运作用来维持神经网膜层的酸碱平衡和电解质平衡，并且参与维生素A 的代谢过程，从而为视网膜感光细胞提供必要的物质基础；每个RPE 细胞一天可吞噬约3 000 个脱落的视网膜光感受器外节盘膜，其吞噬作用是视色素降解和再生循环的一部分；根据研究［6］显示，RPE 细胞的凋亡是引起AMD 的主要病理改变之一，RPE 细胞外泌体可能参与了RPE 细胞的凋亡和存活。黄斑区的RPE 细胞细而高，这种形态使得RPE 细胞在黄斑区代谢中异常活跃。活跃的RPE 细胞线粒体会在能量的储存、释放、转移和利用过程中分泌大量代谢副产物，如过氧化氢、单线态氧、羟自由基、超氧阴离子和活性氧（reactive species，ROS）［7］。其中ROS 的产生可能影响RPE 细胞膜上某些致凋亡基因的表达，或是通过引起DNA 断裂分解、ROS 氧化生物膜过程失衡和蛋白质变性引致细胞死亡。ROS 也可能通过抑制体内多种组织细胞的离子通道活性，损坏细胞膜内外正负电位的平衡，断开RPE 细胞之间的连接、信息交换和血-视网膜屏障的完整性，诱导发生免疫反应和变态反应性炎性，继而损伤RPE 细胞和Bruch 膜，直接导致眼底地图样萎缩及CNV［8］。RPE 细胞来源外泌体与AMD 也有着千丝万缕的联系，玻璃膜疣的形成几率与程度的增大，可能是由RPE 细胞外泌体分泌超出正常生理数量范围下的蛋白所波及影响。氧化应激状态下的外泌体蛋白也可能参与了RPE 细胞的损伤和凋亡。同时，RPE 细胞外泌体对于AMD 形成具有举足轻重影响的CNV 生成可能有刺激作用。此外，RPE 细胞外泌体中包含的大量补体调节因子，它们在AMD 形成过程中的补体激活途径中也可能发挥了重要作用。

3.1 RPE 细胞外泌体与玻璃膜疣

RPE 细胞外泌体可能促进年老的RPE 细胞形成玻璃膜疣。玻璃膜疣为黄白色或透明的凝胶状小体，发生于脉络膜视网膜中，是由于RPE 细胞代谢功能衰减或者发生紊乱，无法被RPE 细胞吞噬消化的代谢产物被分泌出细胞外，并在视网膜发生异常积聚黏连现象的一种退行性疾病，是早期AMD 的主要临床特征。在检测和分析玻璃膜疣的组分过程中，发现其中含有淀粉样物质、补体蛋白、晶体蛋白、C 反应蛋白和免疫球蛋白等多种炎症因子，因此推测，玻璃膜疣可能是RPE细胞功能损伤后产生的炎症反应产物。对于玻璃膜疣的形成过程，Wang 等［9］研究表明，AMD 患者的玻璃膜疣中包含有自体吞噬体和外泌体，并提出了中老年群体AMD 的发生、玻璃膜疣形成与外泌体之间具有的可能性：RPE 细胞自噬作用与RPE 细胞外泌体分泌蛋白的激增诱发AMD 或者影响AMD 发展进程。RPE 细胞外泌体释放的物质中包含着一种αB 晶体蛋白，它是一种小分子热休克蛋白，具有非ATP 依赖的分子伴侣活性，在视网膜光感受细胞外节、视网膜神经节细胞层及RPE 细胞中均有表达。在正常的生理条件下，αB晶体蛋白具有起到保护视网膜神经节细胞的作用［10］，保护RPE 细胞免受氧化应激的诱导损伤。并且αB 晶体蛋白具有特异性生物活性，可以通过与其匹配的受体结合，传递信息，改变细胞的状态与细胞间的联系。随着年龄的增长，RPE 细胞中外泌体标志物CD63 和LANP2 显著增加，显示外泌体介导的胞吐作用增强，可能引发年老的RPE 细胞内蛋白释放增多。在病理状态下，RPE 细胞分泌的含有αB 晶体蛋白的外泌体会增强RPE 细胞表面的诱导凝集作用，RPE 细胞消化代谢功能减退，胞内大量的外节盘膜无法被代谢吞噬完全，基底细胞原生质容纳负荷，保证细胞内的正常运作，RPE 细胞通过胞吐作用将代谢残留的外节盘膜体从细胞中排出。被排出的代谢废物含有色素物质，它们积聚于Bruch 膜，堆砌黏连成团，形成玻璃膜疣［11］。玻璃膜疣会对视细胞层与RPE 层之间造成阻断，导致视细胞层与RPE 层剥离，这样一来，脉络膜到视网膜的营养将被中断，导致视细胞功能的恶化。由于黄斑区结构与功能的特殊性，是眼底视觉最为敏锐的部位，此种改变更为显著。

3.2 RPE 细胞外泌体与脉络膜新生血管

CNV 的形成及其渗漏是造成湿性AMD 视力严重丧失的主要原因。CNV 是指来自脉络膜毛细血管的增生性血管。它通过因废物积聚导致破裂的Bruch 膜持续生长延伸，在RPE 与脉络膜之间、神经视网膜和视网膜色素上皮之间或位于在Bruch 膜与RPE 之间进行扩建，形成结构与功能都不稳定的新生血管。CNV成熟不完全，常在黄斑区RPE 下或神经上皮下发生浆液性或出血性的盘状脱落，造成黄斑区生理功能的严重破坏，浑浊的浆液日积月累可致黄斑区血管发生生理改变，形成视网膜脉络膜萎缩区，患者则表现出视力大幅度并骤然下降、视线所及物体发生形变扭曲，出现视物暗点，是造成永久性视力障碍的主要原因之一。RPE 细胞具有刺激和抑制CNV 生长的双重调节作用。对于湿性AMD 而言，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）对起源于脉络膜或视网膜深毛细血管床的新生血管形成具有强烈的诱导作用，是促进血管内皮细胞增生和移行的刺激因子，也是CNV 形成的重要刺激因素。VEGF 是一种二聚糖蛋白，VEGF 家族又包括胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和VEGF-F。其中VEGF-A 的同种型是眼内新生血管形成和眼内通透性升高的启动因子，它可以诱导眼内血管内皮细胞形成窗孔结构，影响新生血管的成熟。Grunwald 等［12］研究表明，在AMD 患者RPE屏障功能受损的情况下，黄斑区脉络膜血流量减少和渗透压改变，引起低灌注的状态，导致组织细胞的血液流量供应不足和氧气量达不到所需浓度，这将增加VEGF 的表达水平。损伤的RPE 细胞分泌到细胞外基质的外泌体可能携带VEGF 的高度特异性受体，扩散性VEGF 分子将与其二聚化的3 个跨膜受体（VEGF受体1、VEGF 受体2 和VEGF 受体3）结合［13］，RPE 细胞来源外泌体分泌及其携带的VEGF 受体增多时，会促使VEGF-A 受体、VEGF 受体1、VEGF 受体2 结合后，诱导大量蛋白活化，调节血-视网膜屏障，促进视网膜毛细血管内皮细胞生长、分化、增殖，诱导新生血管形成和增加血管通透性［14］，导致血管渗漏和破裂出血，参与CNV 生成发展。与此同时RPE 细胞分泌的外泌体中的其他物质如细胞因子、趋化因子、补体、Toll 样受体和脂质化过氧化产物等单独或协同作用于异常血管的生成，进而引发一系列的继发性病理改变。

3.3 RPE 细胞外泌体与氧化应激

AMD 典型的病理特征之一是RPE 细胞的渐进式凋亡，氧化应激是导致RPE 细胞老化和疾病的一个关键影响因素。它指因刺激破坏了体内的氧化作用与抗氧化作用之间势均力敌的平衡状态，使体内的氧化系统占到主导地位，导致了细胞因超出的氧化程度造成的组织性损伤。氧化应激状态可诱导RPE 细胞来源的外泌体分泌更多，可能导致细胞代谢和凋亡通路的相关蛋白磷酸化，参与调节细胞凋亡。RPE 细胞受到刺激引起去极化也可诱导氧化应激，RPE 电位变化和离子通道改变破坏抗氧化防御系统，使ROS 大量积累，又反过来加剧体内氧化程度，产生恶性循环。近年来，有研究表明，AMD 患者玻璃体腔内存在磷酸化的信号蛋白，Biasutto 等［15］人对成人RPE 细胞进行了实验研究，发现氧化应激状态下的成年人RPE 细胞，其分泌的外泌体中包含72 种蛋白，其中所述的41 种磷酸化蛋白参与了细胞之间的信号传导，从而参与调节RPE 等细胞的凋亡。Atienzar-Aroca 等［16］研究的发现，氧化应激状态下受到损伤的RPE 细胞，向细胞外基质分泌外泌体的数量远远超过正常水平，并在这些外泌体中检测到VEGF 受体1、VEGF 受体2 等调控血管生长因子，当氧化应激水平增强时，VEGF 受体1 和VEGF 受体2的mRNA 水平也明显增加，所以猜测RPE 外泌体可能携带调控血管生长因子VEGF 受体，从而影响临近的血管内皮细胞。这些结果表明氧化应激可能促进RPE细胞来源的外泌体分泌增多，促进视网膜微血管内皮细胞的增殖，诱导新生血管形成生成和CNV 发展，从而参与了AMD 的发生和发展［17］。随着研究的持续深入，人们发现由氧化应激等引起的内质网应激参与了许多神经变性类疾病的过程，且很有可能参与了AMD的病理过程。内质网是内膜构成的封闭网状通道系统，是细胞加工蛋白质的Ca2+的主要贮存场所，在脂质和蛋白为合成中具有核心作用，为新生肤链的折叠提供了良好的环境，确保产出完整折叠、修饰成熟的蛋白。同时，内质网优秀的质量控制能力使错误折叠的蛋白质重新折叠或通过内质网相关降解作用降解非正确的中间产物，保证成熟蛋白在环境中正常工作，防止大量围聚的错误蛋白质对细胞的损伤［18］。内质网应激是细胞为保护内质网内环境的稳定，从而进化出的强大自我保护机制，以保证内质网腔内应对超负荷反应或功能混乱，修正错误折叠或未折叠的蛋白质［19］。综合文献报道［20］，内质网应激导致的启动表明了内质网功能已经紊乱，对RPE 细胞产生致死性的影响，造成RPE 细胞寿命非正常终结，从而参与AMD 病程发展。

3.4 RPE 细胞外泌体与补体途径

Chen 等［21］实验探索发现，补体C3 作为黄斑的组成成分，是年老的RPE 细胞中含量最高的补体成分，在年老的RPE 细胞中广泛存在。同时，CD63 与C3 的联合定位证明了RPE 细胞外泌体与补体C3 在胞外的联系。Ebrahimi 等研究发现［22］，应激状态下的RPE 细胞分泌的外泌体，其表面可包被补体，其中所含的补体调节因子CD46、CD59 通过补体途径激活的过度反应，与相应的受体识别与结合，攻击视网膜细胞及Bruch 膜，破坏两者结构，造成膜表面特定结构裂解产生细胞碎片，影响黄斑区结构与功能。此外，在AMD 患者的玻璃膜疣中存在的CD63、CD81、LAMP2 等外泌体的标志蛋白，在以年龄匹配的对照组中不存在这些蛋白，并且人玻璃膜疣中CD63 共定位蛋白如αB 晶体蛋白、淀粉样蛋白、C5b-9 和CFH 也存在于玻璃膜疣中［23］，这些RPE 细胞分泌的外泌体中所携带的多种蛋白可能参与了异常的补体激活途径以及炎症因子的形成，从而促使玻璃膜疣的形成。以上均表示RPE 细胞外泌体和补体途径可能与AMD 的形成和发展有密切关系。

4 RPE 细胞外泌体与老年性黄斑病变的治疗

由于到目前为止AMD 的确切发病原因没有盖棺定论，AMD 由复杂的多因素复合作用所导致的可能性很高，所以临床治疗AMD 仍然是医疗界的一个难题。目前临床主要有激光光凝、光动力疗法、药物治疗、放射治疗、中药治疗、经瞳孔温热治疗、黄斑下手术等治疗方法，但是对于AMD 病情可控程度不高，临床适用范围窄，治疗效果也并不理想。干性AMD 患者可以每日补充叶黄素制剂、滴七叶洋地黄双苷滴眼液、戴防护眼镜避免有害光线对眼部的伤害以防止病情进一步加重，目前临床尚未有任何有效的治疗方法。湿性AMD常与异常的CNV 有关，应及早用激光光凝以封闭新生血管膜，避免病变恶化。激光疗法中目前应用较多的是氩激光，但其对患者的神经上皮层有一定损害，此外还有氪激光、YAG 激光和最近应用于临床的染料激光，可根据患者病情的发展进度选取适合病症的激光进行治疗。但因激光光凝只能封闭了已经存在的新生血管，对于CNV 的刺激因素产生不了抑制作用，也无法破坏新生血管内壁与其他血管壁的新连接，只能在一定时间段里起到稳定AMD 病情的作用［24］。抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF）药物的出现，很大程度可针对由于VEGF 强诱导CNV 生成的湿性AMD 中，它可有效的抑制或阻断VEGF 对CNV 的刺激，是治疗新生血管性疾病的突破性进展。向湿性AMD 患者玻璃体内注射anti-VEGF药物以抑制CNV 的发生发展并改善患者视力，以达到延缓疾病进展成为AMD 的标准治疗方法。但是anti-VEGF 药物的生物利用度低，无法在患者体内维持持续的作用，满足不了治疗需求，只能通过增加药物的注射频率达到治疗目的。虽然这种治疗方法对病情的控制效果较好，但给患者眼睛造成不少负担，而且大多数患者在治疗一段时间后会产生药物抗性，患者眼底纤维结缔组织增多可行使正常职责的细胞减少，使得VEGF抗体类药物治疗失效，这是湿性AMD 治疗方法的局限性。随着对AMD 研究的不断深入，治疗手段的日趋成熟，多能干细胞体外诱导定向分化RPE 细胞的移植治疗成为治疗AMD 病症的新手段［25］。干细胞定向分化的RPE 细胞移植在模型动物和临床试验患者中都可以实现不同程度的视力改善，但实验样本量较少，还需要花费一段时间进行研究和探索［26］。因此应深入研究一种可以对抗AMD 发病机制所涉及的多种因素的方法，以增加治疗的有效性，提高治疗效果。虽然眼科领域对RPE 细胞外泌体功能的研究还处于起步阶段，但是RPE 细胞来源外泌体治疗AMD 的潜能已得到初步证实。长期以来，外泌体在RPE 细胞中的分泌就被认为对神经具有保护作用，可以改善感光细胞与其相连的其他神经细胞的突起连接，参与细胞-细胞间通信；改善RPE 细胞的结构使其发挥离子泵功能，重建RPE 细胞和感光细胞之间的联系，改善两者间视黄醛-视黄醇的循环［27］。RPE 细胞源外泌体在AMD 的发生、发展中起着重要作用，但是其确切作用及机制尚需进一步的研究。随着科技发展与生活水平，人们对疾病的治疗效果和治疗手段的要求日益提高，外泌体作为一种理想的治疗性药物载体，目前的研究主要集中在肿瘤领域，随着对RPE 细胞外泌体持续深入的研究，RPE 细胞外泌体或可作为药物载体提高药物的生物利用度和临床应用率，用于辅助和治疗AMD 疾病，为AMD 的诊断和靶向治疗提供了新的方向。

5 小结与展望

AMD 是一种由多种因素复合导致的不可逆性致盲眼底疾病，发病机制尚未明确，还需要进行更加全面和深入的研究。随着世界范围中老年人比例的不断攀升，AMD 对中老年造成身体健康的巨大冲击，因此探索治疗AMD 的有效方法，一方面减少患者治疗痛苦，另一方面缓解社会对患者特别是患者家属承担的物质压力和精神负担，成为AMD 研究的重中之重。RPE 细胞外泌体参与RPE 细胞的存活和凋亡，成为AMD 的发病与发展中不可或缺的影响因素。随着科学技术不断发展，对RPE 细胞外泌体临床研究的不断深入，将更系统和准确地了解RPE 细胞来源外泌体与眼部细胞之间的信号机制及其使疾病转归的过程，为未来AMD 的预防和诊治提供更新的途径和进行更早的干预。