药物体外肝代谢研究方法

李 兰 张丹参

河北科技大学，石家庄，050018，中国

药物代谢是指机体对药物在体内的处置过程，其中包括吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和排泄（excretion）4 个阶段［1］。其中药物代谢及转化的主要器官为肝脏，是药物生物转化的主要场所，是富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450 的混合功能的氧化酶系统，药物的Ⅰ相反应（官能团反应）和Ⅱ相反应（结合反应）都是在肝药酶系统的参与下发生的。体外药物肝代谢与体内代谢相比，有许多的优点：①可排除体内诸多的干扰因素，直接观察代谢酶对底物的选择性代谢；②体内代谢转化率低且检测手段不灵敏；③体外代谢研究具有简便快速的特点，适合大量化合物的药动学筛查；④不需消耗较多的样品和实验动物，研究费用相对较少［2］。通过追踪药物化学成分在体内代谢的过程，结合药理活性的研究，有助于阐明药效物质及其作用机制，药物的体外代谢研究在提高药物疗效、安全合理用药、新药研发等方面的意义不可忽视。实验研究中心常用的体外肝代谢方法主要有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝灌流技术、肝组织切片技术、基因重组P450 酶系等［3-4］，并广泛的应用于药物毒理学、药动学及药效学的研究中，根据不同的要求和目的加以选择和利用，可达到理想效果。现对常用的体外肝代谢研究方法进行综述，以期为药物体外肝代谢研究方法在新药研发中的应用提供参考价值。

1 肝微粒体体外温孵法

肝微粒体体外温孵实验是一种利用差速离心技术从动物肝脏中提取肝微粒体，并加入还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）或尿苷二磷酸葡糖醛酸（uridine diphosphate glucuronic acid，UDPGA），在体外模拟生理环境下进行代谢反应。肝微粒体体外温孵法与其他体外肝代谢方法相比具有酶制备技术简便、代谢过程迅速、实验结果重现性优良等特点，此方法可用于药物酶的抑制及体外代谢清除等实验研究中，但是肝微粒体体外温孵法的不足之处是对于体内代谢情况的一致性存在质疑。

Jing Su 等［5］运用体外肝微粒体孵育法鉴定迷迭香酸（rosmarinic acid）的代谢物，在NADPH 或UDPGA的存在下进行了研究。结果表明，通过高分辨液相色谱-串联质谱对样品进行分析共检测到14 种代谢物，其中葡萄糖醛酸作用是主要的代谢途径。

Juan Yang 等［6］采用电化学与在线四级杆飞行时间串联质谱（EC/Q-TOF/MS）联用技术，研究丹参样品中5 种酚酸（迷迭香酸、丹酚酸C、石香酸、丹酚酸香B、原儿茶醛）的氧化转化和代谢途径。

李玥等［7］探讨了丹参酮成分对胆汁酸对小鼠肝微粒体羟基化的抑制作用，研究结果表明，丹参酮对胆汁酸在小鼠肝微粒体中的羟基化代谢有抑制，其中二氢丹参酮Ⅰ起主要作用，临床使用含有二氢丹参酮Ⅰ制剂时应关注其引起胆汁淤积症的风险。

Takashi Isobea 等［8］研究了人、猴、大鼠和小鼠的肝和肠微粒体中柚皮苷的葡萄糖醛酸苷化作用，研究结果表明人肝和肠微粒体中7 糖苷酸的动力学遵循Michaelis-Menten 模型。小鼠肝脏和肠微粒体的动力学也遵循Michaelis-Menten 模型，而猴和大鼠肝脏的动力学微粒体符合双相模型。猴子和大鼠肠道微粒体的动力学分别符合Michaelis-Menten 模型和底物抑制模型。CLint 值为小鼠＞猴子＞大鼠＞人肝微粒体，小鼠＞大鼠＞猴子＞人肠微粒体。在4’-葡萄糖醛酸化中，人肝微粒体以及猴肝和肠微粒体的活性可忽略不计或非常低。大鼠和小鼠肝微粒体的动力学分别遵循双相模型和Michaelis-Menten 模型。对于肝微粒体，CLint值为大鼠＞小鼠，对于肠道微粒体，大鼠＞小鼠＞人。在灵长类动物和啮齿动物中，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）对肝和肠中柚皮苷的代谢能力和区域选择性通常有所不同。

2 肝匀浆体外温孵法

为了使操作过程更加简便，直接采用肝脏匀浆的方法，将药物加入到肝匀浆溶液中，考察其在肝匀浆的代谢情况来说明药物在肝脏中的代谢情况。

解立科等［9］建立了HPLC-Q-TOF/MS 法来研究黄芩苷和黄芩素在体外肝匀浆和肠道菌中的代谢情况，并发现黄芩素和黄芩苷及其18 个代谢物，其中黄芩苷和黄芩素共有的代谢物有12 个（黄芩素、黄芩苷、黄芩素羟基化产物、黄芩素糖基化产物、黄芩素脱羟基产物、黄芩素糖基化甲基化产物、黄芩素的糖基化反应产物、黄芩素糖基化产物、黄芩素羟基化甲基化产物、黄芩素同分异构体、黄芩素羟基化甲基化产物、黄芩素甲基结合物），黄芩苷肝匀浆孵育液中只存在黄芩素甲基化葡萄糖醛酸化产物、黄芩苷脱羟基反应产物、黄芩苷同分异构体、黄芩素的糖基化反应产物，代谢物黄芩素脱水反应产物只存在于黄芩素肝匀浆孵育液中。结果表明黄芩苷和黄芩素的肝脏代谢过程中既有相似性，又有差异性。

孙会仙等［10］应用反相高效液相色谱法研究胸腺素α1（thymosin α1，Tα1）不同位点修饰PEG 聚合物的体外肝匀浆酶的稳定性，研究表明Cys 替换的TC 系列结构修饰物的半衰期均＜Tα1，表明TC 系列更易被肝匀浆代谢；但同一位点PEG 聚合物修饰的PT 系列结构修饰物的半衰期均远＞TC 系列，表明Cys 位点PEG 化后修饰物更加稳定。

3 肝细胞体外温孵法

肝细胞体外温孵法同肝微粒体体外温孵法相似，利用制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，模拟人体生理温度及生理环境进行的代谢方法，该方法适合研究蛋白及mRNA 水平药物代谢酶诱导及酶活性，被广泛用于评估药物代谢过程中药物间的相互作用。

Vacek J 等［11］利用原代培养的肝细胞悬液温孵法研究了槲皮素、芦丁、异槲皮素和花旗松素的体外代谢，运用高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱法分析鉴定了其代谢产物。结果显示，这4 种黄酮类化合物体外肝代谢的主要产物为甲基黄酮醇和葡萄糖苷酸化产物。在孵育的24 h 过程中花旗松素的平均生物转化率最高，为52.45%，主要被转化为硫酸结合物；槲皮素和花旗松素比芦丁和异槲皮苷在原代肝细胞悬液中更容易发生代谢。

顾融融等［12］考察高/低糖培养浓度下，白藜芦醇对人肝肿瘤HepG2 细胞株和人正常肝L-O2 细胞株的代谢组学的研究，运用气相-质谱法分析鉴定了2 种细胞株中代谢组分。结果显示，基础水平下，HepG2 中内源性小分子的水平显著高于L-O2，包括乳酸、氨基酸、胆固醇和脂肪酸等。HepG2 中变化最显著的是十二烷酸、十六碳烯酸、十七碳烯酸和油酸等中长链脂肪酸。L-O2 中高糖培养环境下小分子改变更显著，尤其是氨基酸的水平更高，尿素、肌酸酐、嘌呤和嘧啶等核酸类物质以及泛酸和磷酸等小分子也增加。L-O2 中三羧酸循环的中间产物2-羟基戊二酸、苹果酸的含量上升，以及戊糖磷酸通路中的果糖-6-磷酸、甘油酸水平的上升。

4 肝灌流法

肝灌流法是先从机体分离得到完整的肝脏，再通过人工灌注来维持肝细胞活性和生化功能，并能排除其他组织器官的干扰，此方法被广泛应用于药物毒物代谢、代谢动力学、药物毒理学、药物相互作用等多个领域。肝灌流技术可以分为三类：离体肝灌流、在体肝灌流和在体肠肝灌流技术。在体灌流技术对药物代谢研究范围虽局限于肝脏，但仍无法避免受肝门静脉和动脉血流、神经和激素等内源性物质的影响，而离体灌流技术则不受上述的影响，且由于采样方便，被广泛应用［13］。因此在此部分中我们将主要介绍离体肝灌流法的应用。

离体肝灌流法与肝微粒体法、肝细胞体外温孵法相比，一方面，保留着完整细胞的天然屏障和营养液的供给，具有器官水平的优势，因此能在一段时间内保持肝脏的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有离体系统的优点，能够排除其它器官组织的干扰，可控制受试物质的浓度，定量地观察受试药物体外代谢行为和特点［14］，但离体肝灌流法对实验设备及技术有一定的要求，一定程度上限制了此方法的推广及应用。

陈爱瑛等［15］采用反相高效液相色谱法测定柠檬苦素在大鼠肝灌流液中的含量。结果显示柠檬苦素在0.060～96.000 μg·mL-1（n=9）范围内线性关系良好（r=0.998 8）；定量限为50 ng·mL-1，方法回收率为93.6%～102.1%。本法快速、准确、简便，能够满足柠檬苦素在大鼠肝脏中药动学的研究。

张如洪等［16］在研究异甜菊在大鼠肝脏内的代谢情况采取的实验方法是体外离体肝灌流法，结果表明，经过40～50 min 灌流后，异甜菊醇主要在肝脏中积累，以葡萄苷酸化形式从胆汁排泄，很可能大部分经过胆汁排泄慢慢的消除到粪便中。在体内和体外药动学研究发现，异甜菊醇会在肝脏中会发生葡萄苷酸化。这表明肝脏代谢可能是异甜菊醇消除的主要途径，而异甜菊醇的肾脏消除几乎可忽略。

刘海洋等［17］通过测定离体肝灌流液中的黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）及病理组织学观察，评价黄药子、当归及其相配伍后的水提取物对肝脏毒性作用。实验结果表明黄药子水提取物在灌流液低浓度（1.1 mg·mL-1）、短时间（15 min 以后）即可导致肝细胞损伤，并与浓度和时间呈依赖关系。黄药子与当归以1∶2 比例合煎液中低浓度未见对肝细胞有损伤。黄药子单煎液有明显肝毒性，配伍当归后有明显肝保护作用。

5 肝组织切片法

德国生物化学家瓦勃在1923 年首次建立了手工肝组织切片技术，用微刀片所切取的肝组织厚度不一，此类肝切片中的细胞缺乏再生的能力，容易缺氧死亡［18］。为了克服手工肝组织切片只适合短期实验研究的缺陷，在20 世纪80 年初有人利用组织切片机进行切片，使肝组织切片在切割后达到了厚薄均匀的效果，对肝组织损伤比较小。精确切取的肝组织切片技术被广泛用于病理学、药理学等研究中。肝组织切片法是研究药物代谢及其毒性的有效的体外系统，该方法在不破坏器官的细胞构成和组织结构的情况下，所得结果与体内法相近。肝切片相对于纯化的P450 同工酶、P450 混合酶、肝微粒体、游离的肝细胞来说，不仅完整保留了所有肝药酶及各种细胞器的活性，而且保留了细胞间的联系及一定的细胞间质，更能反映药物在体内生理情况下的实际代谢过程，且可在较长的孵育时间内保持代谢活性（可达8～24 h）；其缺点为切片机的使用受限和精密准确的切片机价格昂贵。

6 基因重组P450 酶系

基因重组P450 酶系是指利用基因工程及细胞工程方法，将人源的CYP450 或UGT 基因转染到大肠埃希菌或昆虫细胞中培养成表达高水平的P450，经纯化后可获得较纯的单一P450 同工酶的体系。通过该酶系，能够定性的研究酶系中单个亚型对整个代谢反应的相对贡献和代谢途径。基因重组CYP450 酶系与肝微粒体实验关联性好，适合对药物代谢进行微观化和细节化的研究［19］。

Ring 等［20］运用基因重组人肝中9 种P450 酶亚型研究了诱导药物Atomoxetine 4 位羟基化反应的P450酶亚型，结果表明，CYP2D6 诱导速率为其他亚型的475 倍，当CYP2D6 浓度较低时，其他P450 酶亚型也可进行低效诱导。因而，临床合并用药时如有CYP2D6的抑制剂，也不能完全预测Atomoxetine 体内清除被抑制。

Jin SE 等［21］运用基因重组P450 酶系法研究了葛根汤、神速汤、小青龙汤、小柴胡汤、人参败毒汤散、九味羌活汤等6 种中药配方在治疗传统感冒过程中对4种关键P450 酶亚型的影响。结果表明，葛根汤能显著抑制CYP2C19、CYP2D6 和CYP2E1 的活性；九味羌活汤对CYP2D6、CYP2E1 活性的抑制作用要强于其它P450 酶亚型；神速汤与小柴胡汤能改变CYP2C19、CYP2E1 介导的药物代谢；人参败毒汤散与小青龙汤对CYP3A4、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 介导的药物代谢没有任何抑制作用。

7 总结与展望

经过多年的发展，传统的体外模型日益完备，肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法及肝组织切片法等肝代谢体外代谢研究方法在分析药物代谢的研究中不仅发挥了重要作用，并且广泛应用于药物的代谢途径，体内代谢清除及药物间相互作用研究等。对于不同的实验要求及实验目的应选择合适的体外代谢研究方法。随着科学研究技术的不断深入，现在的药物代谢研究已不再单纯是化学成分的代谢产物的研究，已经扩展到“组学”范畴，例如代谢组学、基因组学、蛋白质组学，并且与机体的症候/疾病相联系诞生了方证代谢组学，如何建立模拟机体内复杂代谢网络的体外代谢模型。体外肝代谢研究可以针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物的特性进行结构改造，以期能够获得安全、稳定的候选物，根据候选物的代谢特征（如药酶诱导、抑制、参与代谢的药酶种类、活性代谢物的生成等）确定药物的开发应用价值，因而体外肝代谢具有广阔的应用前景。