扶正活血解毒方通过Wnt/β-catenin信号通路对口腔黏膜下纤维化的调控作用

谢赛飞 谭劲 郑玲 朱可可 周领航 陈明

〔摘要〕 目的 探索扶正活血解毒方對槟榔碱提取物（areca nut extract， ANE）诱导的口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis， OSF）Wnt/β-catenin 信号通路的作用机制。方法 体外培养大鼠口腔黏膜上皮细胞（epithelial cell， EC），分为正常组、模型组、中药高/中/低剂量组和IWR-1组。以ANE为诱导剂，扶正活血解毒方含药血清为干预药物，以Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1为阳性对照物，采用CCK8检测EC细胞增殖;PCR检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表达;Western blot检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表达。结果 与正常组相比，模型组EC增殖水平提高，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表达增加，Axin基因及蛋白表达降低（P<0.05）;与模型组相比，中药高、中剂量组EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表达降低，Axin基因及蛋白表达升高（P<0.05）;与模型组相比，IWR-1组EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表达降低，Axin基因及蛋白表达升高（P<0.05）。结论 扶正活血解毒方可通过调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制ANE刺激的EC增殖，逆转OSF癌前病变的形成。

〔关键词〕 口腔黏膜下纤维化;槟榔碱提取物;扶正活血解毒;Wnt/β-catenin信号通路

〔中图分类号〕R285.5        〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.001

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Fuzheng Huoxue Jiedu Prescription on Wnt/β-catenin signaling pathway induced by areca nut extract （ANE） in oral submucosal fibrosis. Methods The rat oral mucosa epithelial cells （ECs） cultured in vitro were assigned into a normal group， a model group， a Chinese materia medica high， medium and low dose group， a IWR-1 group. ANE was inducer， and Fuzheng Huoxue Jiedu Prescription-containing serum was intervention medicine. Wnt/β-catenin signaling pathway inhibitor IWR-1 was the positive control medicine. The CCK8 was used to test EC cell proliferation; PCR was used to detect Wnt1， β- catenin， Axin， cylinD1 gene expression; Western Blot was used to detect Wnt1， β-catenin， Axin， cylinD1 protein expression. Results Compared with the normal group， ECs proliferation levels of the model group increased， and Wnt1， β-catenin， cylinD1 gene and protein expression increased. Axin gene and protein expression decreased （P<0.05）; Compared with model group， ECs proliferation levels of Chinese materia medica high and medium dose groups were reduced， and Wnt1， β-catenin， cylinD1 gene and protein expression were reduced. Axin gene and protein expression increased （P<0.05）; Compared with the model group， ECs proliferation level of the IWR-1 group was reduced， and Wnt1， β-catenin， cylinD1 gene and protein expression were reduced. Axin gene and protein expression increased （P<0.05）. Conclusion Fuzheng Huoxue Jiedu Prescription can inhibit the proliferation of EC cells stimulated by ANE， and reverse the formation of OSF precancerous lesions through regulating Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Keywords〕 oral submucosal fibrosis; areca nut extract; Fuzheng Huoxue Jiedu; Wnt/β-catenin signal pathway

口腔黏膜下纤维化或称口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis， OSF）是一种口腔黏膜潜在恶性疾病[1-2]。其癌变率高达7%，WHO将OSF列为癌前状态[3]。流行病学调查表明，咀嚼槟榔是OSF主要的致病因素，但癌变机制尚不清楚，可能与槟榔的致癌成分槟榔碱、细胞因子、创伤及细胞免疫等关系密切[4-5]，尤其认为某些细胞因子参与了OSF的癌变过程，其中以Wnt与TGF-β1介导的信号通路最具代表性[6-8]。如何阻断TGF-β与Wnt信号通路细胞因子间的联系，将成为防治OSF癌变的关键。前期研究发现扶正活血解毒中药通过调控TGF-β1/Smads信号转导通路能具有抑制槟榔碱提取物（areca nut extract， ANE）刺激的EC细胞增殖的作用[9-11]。本研究将从Wnt/β-catenin信号转导通路的角度探讨扶正活血解毒方对OSF癌前病变的作用机制，为临床OSF癌变的防治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1  实验细胞  口腔黏膜上皮细胞（epithelial cell， EC）购自于中国上海赛百慷生物技术股份有限公司。收到细胞后，选择相差显微镜对细胞进行鉴定，镜下细胞为多角形，胞核大，培养皿中细胞铺满的位置显微镜下可见铺路石状。高倍镜下未见成纤维细胞。

1.1.2  实验药物  （1）槟榔提取物（ANE）购于深圳润慧生物科技有限公司。（2）扶正活血解毒方所用药物为颗粒剂，由广东三九制药有限公司生产，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。具体组方规格如下：丹參10 g，玄参10 g，当归10 g，红花5 g，生地黄10 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，生黄芪10 g，薄荷10 g，白芍10 g，茵陈10 g，桔梗10 g。克数为生药剂量，为同一批次同一产地药材。将以上中药按处方量取14剂，一剂生药（共115 g）加入500 mL温开水冲泡并充分搅拌，使用水煎浓缩的方法将药物浓缩成500 mL液体，生药浓度为0.23 g/mL，药物现配现用。

1.1.3  含药血清  8周龄SPF级雄性SD大鼠20只由湖南中医药大学动物实验室提供，在SPF条件下适应性饲养1周。将大鼠随机分为正常组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组4组，每组5只，其中正常组以0.9%生理盐水组灌胃8 mL/只，中药高、中、低剂量组分别按照活扶正活血解毒方12、8、4 mL/kg灌胃[中药低、中、高剂量大鼠灌胃量按照成人每日用量的1、2、3倍定为等效剂量（正常成人体质量按60 kg进行换算）]，每日2次，连续灌胃7 d。大鼠末次灌胃1 h后，行心脏取血，4 ℃、1  500 r/min离心10 min，取上清56 ℃灭活30 min，将灭活后的血清通过0.22 μm滤器过滤除菌，配置成完全培养基备用[12-13]。

1.1.4  主要试剂  大鼠口腔黏膜上皮细胞完全培养液（上海赛百慷生物技术股份有限公司，批号RATiCELLM013）;胰酶（美国Hyclone，批号SH30042.01）;2.24 μg/mL DispaseⅡ酶（美国Gibco，批号25200-027）;PBS（美国Hyclone，批号SH30256.01B）;CCK8增殖检测试剂盒（日本DOJINDO，批号CK04）;逆转录试剂盒（中国北京康为世纪，批号CW2569）;Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（日本TOYOBO，批号QPK-201）;引物由Genecopoeia合成;Wnt1抗体（英国Abcam，批号ab15251）;β-catenin抗体（英国Abcam，，批号ab32572）;Axin2抗体（英国Abcam，批号ab32197）;cylinD1抗体（英国Abcam，批号ab251892）;IWR-1（美国MCE，批号HY-12238）;羊抗兔二抗（英国Abcam，批号ab6747）;显色液（美国Cyanagen，批号23423）。

1.1.5  主要仪器  全自动化学发光免疫分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司，型号UniCelDxI 800）;Nanno Drop 分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司，型号NDoneC）;基因扩增仪（美国MjRE-SEARCH公司，型号TTC-220）;离心机（中国湖南湘仪，型号H1650R）;Motic显微镜（成贯仪器上海有限公司，型号BA210T）;酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司，型号SpectraMax M4]。

1.2  方法

1.2.1  细胞分组及培养  分离培养的细胞增殖至对数期，将细胞分为正常组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、IWR-1组6组。其中正常组以正常大鼠血清干预，模型组以正常大鼠血清+50 μg/mL ANE干预，中药高、中、低剂量组分别以高、中、低剂量含药血清+50 μg/mL ANE干预，IWR-1组以正常大鼠血清+5 μmol/L IWR-1。

1.2.2  CCK8检测EC细胞增殖  将6组细胞按105/mL浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，共铺5板，检测时间为12、24、36、48 h 4个时间点，在检测前2 h加入CCK8 10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2继续培养至检测时间点，取出培养板，放置于酶标仪中，450 nm和600 nm双波长检测并读数[14-15]。

1.2.3  PCR检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表达  将6组细胞按105/mL浓度接种于T25培养瓶中，培养至细胞长满培养瓶，将其消化、离心、弃上清留存细胞。以RNA提取试剂盒提取细胞RNA，具体操作步骤根据试剂盒中的使用说明进行。RNA提取后，通过逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，具体操作步骤根据逆转录试剂盒说明书进行。再根据反应体系将cDNA与SYBR溶液配比，进行PCR操作，并读取mean CT值和△△CT值。

1.2.4  Western blot检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表达  将6组细胞按105/mL浓度接种于T25培养瓶中，培养至细胞长满培养瓶，将其消化、离心、弃上清留存细胞。将细胞中加入RIPA裂解液充分裂解后离心吸取上清，以BCA蛋白浓度试剂盒测量蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴加热5 min。根据蛋白分子量配置凝胶并电泳、转膜、孵抗体、显色，并读取灰度值。

1.2.5  统计学方法  采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据呈正态分布者采用单因素ANOVA分析，数据非正态者采用非参检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  CCK8检测结果

与正常组相比，模型组EC增殖被抑制，差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，中药高、中剂量组和IWR-1组均促进EC细胞增殖水平，差异均有统计学意义（P<0.05）。详见表1。

2.2  PCR检测结果

与正常组相比，模型组Wnt1、β-catenin、cylinD1基因的表达量增高，Axin基因表达量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，中药高、中剂量组和IWR-1组的Wnt1、β-catenin、cylinD1基因的表达量均降低，Axin基因表达量均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。详见表2。

2.3  Western blot檢测结果

与正常组相比，模型组Wnt1、β-catenin、cylinD1蛋白的表达量增高，Axin蛋白表达量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，中药高、中剂量组和IWR-1组的Wnt1、β-catenin、cylinD1蛋白的表达量均降低，Axin蛋白表达量均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。详见图1、表3。

3 讨论

OSF发病率高，且癌变率目前也有所增高。OSF的发病与多种因素有关，目前研究较多的是槟榔中的致癌成分槟榔碱，以及机体自身的免疫因子和通路，其中Wnt信号通路较为经典。Wnt信号传导通路有以下主要的分支：（1）Wnt/β-catenin通路;（2）WNT-Ca2+通路;（3）细胞极性通路。其中，Wnt/β-catenin通路是经典的、主要的传导通路，本文探讨的为该信号通路。

Wnt/β-catenin信号通路是一个由多种分子参与、相互影响及制约的复杂的信号转导系统，对细胞增殖和分化具有重要调节作用，Axin蛋白是Wnt信号通路中为一个重要的构形蛋白，它串联起腺瘤病大肠杆菌蛋白（adenomatosis polyposis coli， APC）、β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β， GSK-3β）蛋白形成一个复合体，在正常情况下，这个复合体可使β-catenin磷酸化后被相关酶降解。但在异常情况下，Wnt配体-受体复合物抑制APC、β-catenin、GSK-3β降解复合体的稳定性，使β-catenin降解障碍，胞浆内游离的β-catenin聚集，在细胞质中达到一定浓度后进入细胞核，与转录因子相互作用，激活Wnt/β-catenin信号通路使得下游癌基因表达增加。其中cyclinD1是Wnt信号通路的一个下游基因，为细胞G1/S期的特异性周期蛋白，主要功能是刺激细胞增殖，其过度表达可以导致细胞失控，从而导致细胞癌变。

本试验通过体外培养EC细胞，以CCK8检测EC细胞的增殖，以PCR检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表达，以Western blot检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表达。其检测结果可见，模型组加入ANE后，EC细胞的增殖水平明显提高，且ANE促进了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因和蛋白的表达，降低了Axin基因和蛋白的表达。中药高、中剂量组下调了EC细胞的增殖水平，且下调了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白的表达，上调了Axin基因和蛋白的表达，高剂量组下调水平优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组，呈现一定的药物量效关系。IWR-1组通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，从而降低了EC细胞的增殖水平，下调了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白的表达，上调了Axin基因和蛋白的表达。

中药具有疗效可靠、靶点多、无副作用而且来源广泛等优点。谭劲教授在古方桃红四物汤的基础上加减选用，由丹参、玄参、当归、红花、生地黄、白花蛇舌草、夏枯草、生黄芪、薄荷、白芍、茵陈、桔梗十二味中药制成扶正活血解毒方。方中丹参、当归、红花活血化瘀;生黄芪、白芍益气扶正;生地黄、玄参、茵陈、薄荷养阴清热;白花蛇舌草、夏枯草解毒散瘀;桔梗化痰散结。现代药理研究也表明，白花蛇舌草、夏枯草具有抗癌、增强免疫、抑制炎症因子的作用，桔梗祛痰效果显著[16-18]。全方诸药合用，共奏扶正活血、祛痰解毒之功。

从本实验结果可以看出，ANE能够促进EC细胞的增殖，也可以激活Wnt/β-catenin信号通路，促进相关基因及蛋白的表达，说明咀嚼槟榔可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路进而促进了OSF的发生。扶正活血解毒方能够抑制Wnt/β-catenin信号通路，降低EC细胞的增殖。IWR-1组通过加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1抑制了该信号通路，降低了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白的表达，上调了Axin基因和蛋白的表达，中药组与IWR-1组在Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因及蛋白的表达上无明显差异。这表明中药扶正活血解毒方是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而降低EC细胞增殖产生疗效。

综上所述，本研究从Wnt/β-catenin 信号转导通路的角度探索了扶正活血解毒方的起效机制，该结果为其临床疗效提供了理论依据，同时也为临床OSF癌变的防治提供新的实验依据。然而本实验尚存在一定的不足，在探索扶正活血解毒方对OSF的影响时，未增加在体动物实验以及临床试验作为理论支持，这也是我们课题组后期的研究方向。

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