酱油中微量乙醇的气相色谱分析方法的建立

刘晓艳，覃旋，钱敏，白卫东*，黄汉聪，杨红，黄丹彤

(1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广州 510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制 重点实验室，广州 510225；3.广州市如丰果子调味食品有限公司，广州 510300)

作为我国传统的调味食品，酱油一般是以大豆或脱脂大豆、小麦或麸皮等为原料，经多种微生物共同发酵而成。酱油的香气是评价其质量的重要指标之一，而乙醇是酱油重要的特征香气成分[1-4]，乙醇的含量对酱油的营养价值与卫生指标也有重要影响[5-7]。日本对出口的A级酱油规定，其乙醇的含量要大于800 mg/dL[8]。目前我国酱油生产中采用的纯种发酵技术使得所生产的酱油香气较单薄，所以酱油的生产将倾向于在发酵中后期添加特定酵母菌来加强酒精发酵，以产生适量的乙醇改善酱油的风味[9-11]。因此，检测酱油中乙醇含量是酱油生产过程中控制质量、指导生产不可缺少的手段。目前，采用气相色谱对酒类、药品、香精香料化妆品中微量乙醇进行分析检测的报道较多[12-18]，而酱油中乙醇的气相色谱分析尚未见文献报道。

本文采用气相色谱对酱油中微量乙醇进行分析测试，省去了传统测试方法中蒸馏过程与手工测定比重等繁琐操作，大大简化了乙醇测试的操作过程；且减少了萃取、蒸馏等处理过程中乙醇的损失。分析的速度快、干扰小、灵敏度高、数据可靠，适用于酱油生产及酱油产品中微量乙醇的检测，研究结果为酱油酿造过程中质量控制及保证酱油品质提供了技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

试验原料：酱油，购于超市。

乙醇、乙腈(色谱纯)：Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 仪器与设备

7820A气相色谱仪 安捷伦科技有限公司；旋转蒸发仪 东京理化器械独资工厂；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司；离心机、涡旋混合器 美国Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取方法的选择

取5，2，2 mL酱油至 15 mL 离心管中，分别加入5，8，10 mL乙腈，拧紧瓶盖，漩涡混匀1 min，以4000 r/min离心3 min，将上层有机相转入进样瓶中，供 GC测试。

对比酱油样品与乙腈的在V(酱油)∶V(乙腈)为1∶1(5 mL酱油+5 mL乙腈)、V(酱油)∶V(乙腈)为1∶4 (2 mL酱油+8 mL乙腈)、V(酱油)∶V(乙腈)为1∶5(2 mL酱油+10 mL乙腈)时样品中乙醇提取的量，得到萃取的最佳条件。

1.3.2 色谱分析条件

色谱柱：HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID检测器温度：250 ℃；氢气流速：35 mL/min；空气流速：400 mL/min；尾吹(N2)流速：25 mL/min；柱流速：1 mL/min；分流比30∶1；进样口温度：200 ℃；柱温平衡时间：1.0 min；程序升温：40 ℃保持5.5 min，以20 ℃/min的速度升至200 ℃，保持后，运行30 min。

1.3.3 标准曲线的绘制

准确称取乙醇1.0000 g，用超纯水定容到100 mg/L容量瓶中，得到10 mg/mL的储备液；分别准确量取10.0 mg/mL储备液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到浓度为10，20，40，60，80，100 mg/L的标准溶液。按 1.3.2色谱分析条件上机测定。以标准溶液的浓度为横坐标，对应的峰面积值为纵坐标，绘制乙醇标准曲线；并进行线性回归，计算相关系数R2。

1.3.4 方法精密度

取3种酱油样品，每种2 mL 至 15 mL 离心管中，采用 1.3.1 优化后的样品提取方法萃取后，按 1.3.2色谱分析条件上机分析，每种样品由同一操作人员连续重复分析检测 6 次。根据乙醇标准曲线，求出乙醇含量，并计算方法的相对标准偏差(RSD)。

1.3.5 加标回收率

分别取2 mL 酱油于3个15 mL离心管中，加入乙醇对照品(乙醇浓度分别200，300，500 mg/L)，制备成3组不同浓度的样品。采用 1.3.1 优化后的样品提取方法萃取后，按 1.3.2 色谱条件进样，上机测定，所得的乙醇含量减去酱油样品中的乙醇含量，即为加入乙醇的实测值。将实测值与理论值比较，得到方法的回收率。

1.3.6 方法的初步应用

采用本文建立的方法检测5种市售酱油中的乙醇含量，重复检测5次。

2 结果与分析

2.1 萃取条件的选择

使用乙腈为酱油中乙醇的萃取剂时，乙腈的用量对萃取结果有重要影响。分析比较不同乙腈用量对酱油中乙醇萃取结果的影响，结果见图1。

图1 不同乙腈用量对乙醇萃取结果的影响Fig.1 The effect of acetonitrile volume on ethanol extraction

由图1可知，当V(酱油)∶V(乙腈)为1∶4(8 mL乙腈+2 mL酱油)时，所检测的乙醇含量最高，说明当V(酱油)∶V(乙腈)为1∶4(8 mL乙腈+2 mL酱油)时萃取效果最好。

2.2 线性范围和检出限

取1.3.3配制的100 μg/L乙醇标品工作液，在1.3.2色谱分析条件下进行分析测定，得100 μg/L乙醇标品的气相色谱图，见图2。

图2 100 μg/L乙醇标品的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of 100 μg/L ethanol standard solution

由图2可知，在该色谱条件下，乙醇的保留时间为4.327 min，色谱峰分离良好。

将配制好的6个标准工作溶液在1.3.2色谱条件下测定，得到乙醇含量。以标准工作溶液的进样浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制乙醇的标准曲线，并进行线性回归(见图3)，计算相关系数。

图3 乙醇标准曲线Fig.3 The standard curve of ethanol

由图3可知，乙醇标准曲线的回归方程为y=0.2844x+0.1374，相关系数R2=0.998，说明当乙醇浓度在10～100 mg/L范围时，方法的线性关系良好；以3倍信噪比(S/N=3)确定检测限2.3 mg/L，满足微量乙醇的定量分析要求。

2.3 精密度试验

采用本方法对3个酱油样品中乙醇分别进行了 6 次平行独立测定，以考察检测方法的精密度，结果见表1。

表1 精密度试验结果(n=5)Table 1 The precision test results(n=5)

由表1可知，3组测定结果的RSD分别为2.61%、2.80%、2.55%，说明采用本方法的精密度良好。

2.4 加标回收率

对酱油样品中乙醇进行了加标回收试验，3种不同浓度加标水平为200，300，500 mg/L。按以上试验方法进行测定，计算酱油中乙醇的平均加标回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 加标回收率试验结果Table 2 The recovery test results

由表2可知，本方法的加标回收率为97.86%～101.87%，RSD为0.58%～2.91%，说明本方法的准确度能够满足酱油中微量乙醇的分析要求。

2.5 酱油样品的测定

按照本文建立的方法测定了市场上5种酱油中乙醇的含量，结果见表3。

表3 实样测试结果Table 3 The sample testing results

由表3可知，5种酱油中乙醇的含量为479.60～4809.33 mg/L，与相关报道一致[19-20]；上述5种酱油中乙醇的含量与日本出口的A级酱油中乙醇的含量尚有一定差距，可能与我国酱油生产厂家忽视了对乙醇含量的检测和酱油发酵工艺的研究有关。RSD在0.85%～3.78%，说明本文建立的采用气相色谱测定酱油中微量乙醇的方法有良好的适用性，能够满足酱油中微量乙醇的检测要求。

3 结论

本文建立了气相色谱测定酱油中微量乙醇的方法：采用乙腈为溶剂，酱油∶乙腈为1∶4(V/V)。该方法线性关系良好，相关系数为0.998，检出限为2.3 mg/L，样品的加标回收率为97.86%～101.87%，相对标准偏差RSD为0.58%～2.91%。实际样品分析结果表明，该方法具有前处理简便、分析时间短等特点，而且其精密度高，能满足酱油生产及酱油产品中微量乙醇的检测，研究结果为酱油酿造过程中质量控制及保证酱油品质提供了技术支持。