液相色谱-串联质谱法测定饲料中喹噁啉类药物的不确定度评价

贾 铮，李 兰，赵根龙，周 剑，肖志明，李 阳，樊 霞

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，国家饲料质量监督检验中心（北京），北京 100081）

喹噁啉类化合物（Quinoxaline，QELs）是一类具有抗菌活性的物质，代表性药物主要有喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹和喹烯酮，均属于化学合成喹噁啉-1，4-二氧化合物[1]，自20 世纪70 年代以来已被广泛用于畜禽养殖生产中[1]。随着人们对喹噁啉类化合物认识的深入，其毒性作用对动物带来的损害以及造成食品安全的风险越来越受到广泛的关注[2]。2017 年“3.15”媒体曝光了部分厂商存在超范围、超剂量使用药物饲料添加剂，其中喹乙醇榜上有名。为配合农业行政主管部门迅速、有效地打击饲料生产和养殖环节违法使用喹噁啉类兽用抗菌药物的行为，有必要对饲料中此类药物检测方法的不确定度进行准确评定，以提高测量的准确性和精密度，为此类药物的监管提供相应的技术支撑。

喹噁啉类物质含量的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[3-4]和高效液相色谱串联质谱法（HPLCMS/MS）[5-8]，本文参考《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135-2005）[9]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1-2012）[10]，在采用标准方法《饲料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的测定液相色谱-串联质谱法》（农业部2086 号公告-5-2014）[11]进行试验的基础上，优化试验操作步骤，并对配合饲料中4 种喹噁啉类药物含量进行添加回收试验，对检测方法的不确定度来源、评价、合成以及量值结果进行探讨，建立该方法的测量不确定度模型，对方法不确定度进行定量计算，为相应检测数据的正确评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 色谱级乙腈、甲醇、甲酸（Fisher 公司）；盐酸、二甲亚砜、磷酸二氢钾均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；HLB 固相萃取小柱（200 mg，6 mL）（美国Waters 公司）；标准品卡巴氧（Carbdox）（纯度≥99%）、喹乙醇（Laguindox）（纯度≥99%）、喹烯酮（Qaincetone）（纯度≥98.5%）（Sigma-Aldrich 公司），乙酰甲喹（Meguindox）（纯度≥99.8%）（加拿大TRC公司）。

1.1.2 主要仪器 液相色谱-串联质谱仪：Finnigan TSQ Quantum Discovery Max（美国Thermo 公司）、3K15型离心机（美国Sigma 公司）、Eyela MG-2200 型氮吹仪（东京理化器械株式会社）、BP310s 型电子天平（赛多利斯公司）、BP211D 型电子天平（赛多利斯公司）、Q2-866 型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、SK3300 型超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 混合标准溶液配制 准确称取卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇各10 mg（精确至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加入20 mL 二甲亚砜使固体溶解完全，之后用乙腈定容至刻度，混匀，转移至试剂瓶，于-20℃冰箱内避光保存。作为4 种喹噁啉类兽药的混合标准储备液，该溶液中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇浓度均为100 μg/mL，准确移取混合标准储备液1 mL 于100 mL 容量瓶内，用乙腈稀释至刻度作为混合标准工作液，该溶液中4 种化合物浓度为1 μg/mL。

1.3 样品提取 准确称取饲料样品2 g（精确至0.001g），置于50 mL 聚乙烯离心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，涡旋混合1 min，超声提取10 min，取出后放入离心机以9 000 r/min 离心5 min，收集上清液于50 mL聚乙烯离心管中；按照上述步骤重复提取1 次，合并提取液，混匀。准确量取5.0 mL 提取液（为分取液）于10 mL 试管中，60℃下氮气吹至约2 mL，加入4.0 mL 0.1 mol/L 磷酸二氢钾充分溶解，备用。

1.4 样品净化 选用6 cc HLB 固相萃取柱对提取液进行净化，分别用3 mL 甲醇、3 mL 水活化固相萃取柱，将1.3 样品提取液过柱，控制过柱速度在1 mL/min 以内，以3 mL 0.02 mol/L 盐酸和3 mL 5%甲醇溶液淋洗固相萃取柱，挤干，以5 mL 甲醇洗脱2 次，收集并合并2次洗脱液，于60℃下氮气吹干。准确加入20%乙腈溶液1 mL，超声5 min，涡旋振荡1 min，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.5 基质匹配标准溶液 称取空白配合饲料样品，按1.3～1.4 步骤操作制得1 mL 空白基质样品溶液，分别移取适量的卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇混合标准工作液，60℃下氮气吹干后，加入1 mL 空白基质样品溶液溶解，配制成浓度为200 ng/mL 的基质匹配标准溶液，超声5 min 溶解残余物，涡旋1 min，经0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.6 仪器分析条件

1.6.1 液相色谱条件 色谱柱：C18 柱，50 mm×2 mm，2.1 μm，美国Thermo 公司；柱温：30℃；流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL。

1.6.2 质谱条件 离子源：ESI；电喷雾电压：4 000 V；雾化温度：350℃；辅助气流速：8 L/min；扫描方式：正离子扫描；检测方式：SRM。

2 结果与分析

2.1 数学模型 对基质匹配标准溶液进样，以峰面积为纵坐标、基质匹配标准溶液浓度为横坐标，采用单点法对样品进行定量。以试验前处理步骤和仪器条件对添加一定浓度各化合物的配合饲料样品进行测定，平行测定6 次得到各化合物含量的平均值分别为卡巴氧0.334 mg/kg、乙酰甲喹0.342 mg/kg、喹乙醇0.455 mg/kg、喹烯酮0.379 mg/kg。

试样中待测物质含量X（mg/kg）的计算公式：

式中，A为试样溶液中待测药物的峰面积；As为基质匹配标准工作液中待测药物的峰面积；Cs为基质匹配标准工作液中待测药物浓度（μg/mL）；V为溶解残余物的体积（mL）；m为样品的质量（g）；V1为分取液体积（mL）；V2为提取液总体积（mL）。

2.2 不确定度来源分析 从检测方法可以判断，引入不确定度因素主要有样品质量、样品前处理、标准溶液配制、检测仪器、样品的回收率以及测量重复性等，各不确定度来源因果关系见图1。

图1 配合饲料中4 种喹啉类兽药含量测定的不确定来源

各影响因素相互独立，且计算公式中各量值为乘除关系，因此合成标准不确定度可以表征：

2.3 不确定度评定

2.3.1 样品质量m引入的不确定度 样品质量m引入的不确定度主要包括天平校准产生的不确定度u1（m）和天平重复性产生的不确定度u2（m），试验中使用的电子天平鉴定证书给出的重复性为1 mg，最大允许误差为5 mg，按均匀分布考虑，6 次样品称量的平均值是2.019 g，则校准产生的相对标准不确定度：

2.3.2 样品提取、净化过程溶液体积V引入的不确定度

2.3.2.1 提取液体积 在环境温度为20℃条件下，10 mL移液器吸取10 mL 溶液时容量允许误差为±0.6%，则校准不确定度为：u1（V1000）=α/k=10 000×0.6%/ √—3=34.64 μL，温度引入的不确定度：提取液为0.1% 甲酸乙腈溶液（4+6），在95%的置信系数下，温度引起的体积变化：ΔV=V×液体膨胀系数×ΔT=7.92×0.002 07×3+0.08×0.001 03×3+12×0.001 37×3=0.098 7 mL，温度引入的不确定度计算公式：u2（V1000）=α/k=0.098 7/1.96=50.35 μL；则10 mL 移液器引入的标准不确定度：

由此可以计算出提取液总体积V2的相对标准不确定度：urel（V2）

2.3.2.2 分取液体积 过固相萃取柱的提取液体积 使用了5 mL可调节移液器，其不确定度：u1（V5000）=α/k=，温度引入的不确定度：ΔV=V× 液体膨胀系数× ΔT=1.98×0.002 07×3+0.02×0.001 03×3+3×0.001 37×3=0.024 7 mL，温度引入的不确定度计算公式：u2（V5000）=α/k=0.024 7/1.96=12.6 μL，则相对标准不确定度为：

2.3.2.3 定容体积 定容体积V使用了1 mL 可调节移液器，其不确定度：u1（V5000）=α/k=1 000×0.6%/√—3 =3.464 μL，温度引入的不确定度：ΔV=V×液体膨胀系数×ΔT=0.80×0.001 80×3+0.20×0.001 37×3=0.005 12 mL，温度引入的不确定度计算公式为：u2（V5000）=α/k=0.005 12/1.96=2.61 μL，则相对标准不确定度：

因此，样品在提取、净化过程中由体积变化引入的相对标准不确定度：

2.3.3 标准溶液浓度 引入的不确定度

2.3.3.1 标准品纯度引入的不确定度 由对应标准物质证书查得，卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相对扩展不确定度均为±1.0%，包含因子k=2，则其相对标准不确定度：urel（p）=1.0%/2=0.005；乙酰甲喹的相对扩展不确定度为0.3%，包含因子k=2，则相对标准不确定度： urel（V3）=0.3%/2=0.001 5。

2.3.3.2 标准品称量m引入的不确定度 包括天平校准产生的不确定度u1（ms）和天平重复性产生的不确定度u2（ms），试验中使用的电子天平鉴定证书给出的重复性为0.05 mg，最大允许误差为0.05 mg，按均匀分布考虑，则校准产生的相对标准不确定度：

2.3.3.3 定容体积引入的不确定度 包括容量瓶校准引入的不确定度u1（V100）、温度引入的不确定度u2（V100）、容量瓶估读误差引入的不确定度u3（V100）。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196-2006）[12]规定，100 mL容量瓶的允差为±0.10 mL，按均匀分布考虑，引入的不确定度：u1（V100）=0.10 mL/=0.057 7 mL。

用水对100 mL 容量瓶进行10 次的定容和称量试验，得到标准偏差为0.06 mL，则标准不确定度：u（1V100）

测定时的试验环境为23℃，与容量瓶校准时的温度（20℃）相差3℃，乙腈的膨胀系数（20℃）为0.001 37，在95%的置信系数下，温度引起的体积变化：ΔV=V×液体膨胀系数×ΔT=100×0.001 37×3=0.411 mL，温度引入的不确定度：u2（V100）=α/k=0.411/1.96=0.209 7 mL；从而得到100 mL 容量瓶的合成标准不确定度：

相对标准不确定度为：urel（V100）=u（V100）/100=0.217/100=0.002 183。

2.3.3.4 稀释引入的不确定度 根据《移液器计量检定规程》（JJG 646-2006）[13]，在环境温度为20℃条件下，1 mL移液器吸取1 mL 溶液时容量允许误差为±1.0%，则校准不确定度：u1（V1）=α/k=1 000×1.0%/=5.775 μL。

温度引入的不确定度计算公式：u2（V1）=α/k=100×0.001 37×3/1.96=0.209 7 μL。

则1 mL 移液器引入的标准不确定度：

相对标准不确定度：ure（lV1）=5.779/1000=0.005 779。

100 mL 容量瓶体积的不确定度分析同2.3.3.3 中容量瓶体积不确定度的计算，得到urel（V100）=0.002 183 mL。

稀释过程按1:100 稀释，引入的相对标准不确定度：

标准溶液引入的相对标准不确定度：

经过计算，得到因标准溶液引入的卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相对标准不确定度urel（Cs）=0.010 27，乙酰甲喹urel（Cs）=0.009 103。

2.3.4 重复性引入的不确定度 测量重复性引入的不确定度主要受实验人员的熟练程度、仪器自身性能等因素影响，包括称量的重复性、样品提取和净化过程中溶液体积变化的重复性、仪器检测的重复性等，均属于A类不确定度。本试验将6 次平行测定的各组分含量值带入贝塞尔公式，计算4 种化合物的标准偏差、标准不确定度和相对标准不确定度，结果见表1。

2.3.5 添加回收率R 引入的不确定度 由表2 可见，6 次样品添加回收试验得到的卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇和喹烯酮的添加回收率分别在80.7%～89.5%、80.9%～96.0%、87.2%～94.4%、85.5%～101.3%。

采用t检验法对各化合物平均回收率与1.0 进行显著性检验，代入公式t=/－ 1.0//S（R）计算各化合物t值，与t（0.05,5）=2.015 比较以确定回收率是否计入含量的计算中。4 种化合物的t值分别为卡巴氧：t=4.53，乙酰甲喹：t=2.21，喹乙醇：t=2.59，喹烯酮：t=0.82，由计算结果可知，卡巴氧、乙酰甲喹和喹乙醇3 种化合物须采用回收率因子R修正结果。

2.3.5 合成不确定度、扩展不确定度及结果表示 由公式ure（lX）=计算得到4 种喹噁啉类药物的合成不确定度，根据《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135-2005）中规定的一般正态分布、95%的置信区间对应的k=2，则各化合物的扩展不确定度为U=urel××2，从而计算得到采用液相色谱-串联质谱方法测定配合饲料中4 种喹噁啉类药物含量不确定度的结果，见表3。

3 结 论

本研究对液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中4种喹噁啉类兽药含量的测量不确定度的评定结果表明，影响测量不确定度的主要因素是测量重复性、添加回收率，其次是标准溶液配制和提取、净化过程的溶剂体积变化，而样品称量过程引入的不确定度较小。因此，在实际操作过程中可以从试验操作能力、仪器设备、测量重复性等方面考虑，通过培训提高操作人员的检化验水平、增加平行样测定次数、定期检定仪器设备、保持HPLC-MS/MS 的灵敏度和稳定性以及严格控制实验室环境等方式，尽量减小测量不确定度，从而保证检测结果的准确性和重复性。

表1 含量测定结果数据

表2 回收率测定结果数据

表3 各组分扩展不确定度及结果表示