长白猪PPARα、PPARγ 基因的克隆、表达及生物信息学分析

郭振清，李红强，孙 健

（河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北昌黎 066600）

白色脂肪组织主要以储存能量为主，而棕色脂肪主要以消耗能量和产生热量为主[1]。研究发现脂肪组织形成的起始阶段、分化阶段和成熟阶段受到各种转录因子调控，其中PPAR 家族蛋白在各阶段发挥重要作用[2]。PPAR 家族属于配体激活类转录因子，可被细胞内游离脂肪酸和脂肪酸代谢物等多种配体激活[3-4]，PPAR 蛋白与靶基因启动子的特异靶向元件序列结合，随后与类维生素A 受体形成异源二聚体驱动生理或病理条件下基因的表达[5-6]。PPAR 家族蛋白调控特异性靶基因的表达[7]，参与脂代谢、葡萄糖稳态、肥胖、癌症、炎症和动脉粥样硬化等生物学过程[8-9]，该家族有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3 个成员，其在不同的组织中表达。PPARα主要在脂肪酸氧化率较高的组织中表达，如肝脏、心脏、肌肉和棕色脂肪组织等[10]，参与游离脂肪酸激活和延伸及去饱和、甘油三酯及脂滴的合成与分解、载脂蛋白代谢、糖异生和胆汁酸代谢等多种生物学过程。PPARβ/δ主要在肌肉中高表达，其次为脂肪组织和皮肤。PPARγ主要在脂肪组织中高表达[11-12]，在调节脂肪细胞分化、脂质生成和代谢方面具有十分重要的作用，其在炎症反应中也发挥重要作用[2]。

目前对于该家族的研究主要集中在小鼠[13-14]，而以猪为对象的研究较少。猪肉品质（多汁性、风味、柔软程度）与脂肪沉积紧密相关[15]，如何改善脂肪沉积一直是育种工作者的重要目标。本研究通过构建长白猪PPARα、PPARγ真核表达载体并对其进行生物信息学和组织表达规律分析，为进一步揭示PPARs在猪中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验选择6 月龄去势长白公猪，来自河北省秦皇岛市昌黎县肉联厂，采集长白猪新鲜心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腿肌、颈阔肌、肱二头肌、皮下脂肪、胃、小肠和空肠12 种组织样品，样品采集后迅速置于液氮中，以备后续实验使用，所有样品均在-80℃低温保存。

1.2 主要试剂 Trizol、PCR 相关试剂、RNA 反转录试剂盒、pMD18-T Vector、感受态细胞DH5α和DL2000 DNA Ladder 购自北京索莱宝生物科技有限公司；普通琼脂糖凝胶回收试剂盒（美国Omega 公司）；DEPC、Goldenview 型核酸染色剂购自北京拜尔迪生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；普通PCR 仪（ABI17500，美国ABI 公司）；定量PCR 仪（赛默飞世尔，美国）；电泳仪（DYY-4C 型，北京市六一仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计和合成 参考GenBank 数据库中猪PPARα（登录号：NM_001044526），PPARγ（登录号：NM_214379.1）序列，使用Primer 5.0 软件设计引物[16]（表1）并由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

1.3.2 总RNA 提取和反转录 取适量组织加入到预冷的2 mL EP 管中，随后加入1 mL 的Trizol 试剂，使用组织破碎仪（70.0 HZ，20 s）连续破碎5 次后加入200 mL氯仿，随后12 000 r/min 低温离心15 min；将上层液体移至新EP 管中并加等体积异丙醇，混匀后放置10 min，12 000 r/min 低温离心15 min；将上层液体弃去留下底部沉淀，加入1 mL 75%乙醇，重复该过程，最后加20 μL DEPC 水溶解总RNA，并用反转录试剂盒将提取的总RNA 反转录成cDNA，方法参照试剂盒说明书。

1.3.3 基因扩增 以cDNA 为模板，利用上述引物（表1）通过PCR 技术扩增长白猪PPARα、PPARγ基因。PCR反应总体系为10 µL：5 µL 2×Taq Master Mix、100 ng/μL模板1 µL、上下游引物（10 pmol/L）各0.5 µL、3 µL H2O。PCR 扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃，5 min；20℃，5 min。将PCR 回收产物与pMD18-T 载体连接，连接体系为10 µL：目的片段6 µL，载体2 µL，Buffer 1 µL 和pMD18-T 连接酶1 µL，16 ℃连接过夜后转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌株并进行PCR 鉴定。以上述重组载体为模板利用PCR 技术克隆基因CDS 序列，与pcDNA3.1 载体相连，随后转化至DH5α感受态细胞，最后挑取单菌落并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.4 生物信息学分析 采用表2 中的各种工具对长白猪PPARα、PPARγ对应序列进行生物信息学分析。PPARα、PPARγ物种类型分别为人（Homo sapien）、猕猴（Macaca mulatta）、小鼠（Mus musculus）、猪（Sus scrofa）、牛（Bos tauru）、山羊（Capra hircu）、绿头鸭（Anas platyrhynchos）、鸡（Gallus gallus）。

1.3.5 基因组织表达分析 以12 种组织的cDNA 为模板，使用定量PCR 引物序列（表1），参照TAKARA SYBR®Premix Ex TaqTMII 试剂盒进行荧光定量PCR 检测基因在各组织中的表达量。PCR 反应体系20 μL：SYBRqPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，去离子水6.8 μL。PCR 反应条件：预变性95℃ 5 min；循环反应，95℃10 s，60℃ 30 s，共40 个循环。采用GAPDH为内参校正个体间差异，利用2-△△Ct方法计算长白猪PPARα和PPARγ在各组织中的相对表达量，并使用GraphPad Prism5 软件[19]将表达量进行单因素方差分析。

表1 PCR 引物序列信息

表2 生物信息学软件[17-18]

2 结果

2.1 长白猪PPARα、PPARγ基因的扩增 由图1-A 可知，与DNA Ladder Marker 相比，1、2 泳道条带均处于1 000～2 000 bp，PPARα序列长度为1 407 bp，PPARγ序列长度为1 515 bp，扩增片段大小与理论产物一致。将扩增产物与载体连接并转化至感受态细胞，挑取单菌落并提取质粒，使用PCR 技术检测质粒并经琼脂糖凝胶电泳检测（图1-B），发现构建好的载体大小于预期相符合，经生工生物工程（上海）股份有限公司测序获得核苷酸序列与NCBI 数据库公布的序列一致。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 蛋白质的一级结构 分析长白猪PPARα基本理化性质显示，编码468 个氨基酸，其分子量为52.17 ku，理论等电点为5.77，含有亮氨酸（Leu）个数为49，比例最高，为10.5%，而色氨酸（Trp）个数为1，比例最低，为0.2%，其分子式为C2308H3654N618O695S31，总原子数目为7306。PPARγ编码504 个氨基酸，分子量为57.51 ku，理论等电点为5.60，其中亮氨酸（Leu）比例最高，为10.5%，而色氨酸（Trp）比例最低，为0.2%，含有负电荷氨基酸残基的数目为71，含有正电荷的氨基酸残基数目为58，其分子式为C2575H4046N670O766S27，总原子数量为8 084。

2.2.2 蛋白质二级结构预测 长白猪PPARα二级结果分析显示，α螺旋、无规卷曲、伸展链和β转角分别占48.93%、35.90%、10.68%和4.49%。长白猪PPARγ二级结构分析显示，α螺旋、无规卷曲、伸展链和β转角分别占比为46.63%、34.92%、12.30%和6.15%。该结果显示这2 种蛋白α螺旋和无规卷曲是其主要结构。

图1 长白猪PPARα 和PPARγ 基因的PCR 扩增结果

2.2.3 蛋白质跨膜结构域和疏水性预测 跨膜结构域分析结果显示，PPARα蛋白不含有TMHs，同样PPARγ预测发现其TMHs 数量为0，推测这2 种蛋白均不含有跨膜结构域。亲疏水性算法认为大于0.5 的区域为疏水区，小于-0.5 的区域为亲水区，在-0.5～0.5 的区域为两亲区域。结果显示长白猪PPARα亲疏水性的最小值为-3.078，最大值为2.933，亲水性区域大于疏水性区域，因此推测该蛋白为亲水性蛋白。长白猪PPARγ亲疏水性分析发现，最小值为-2.789，最大值为3.6，亲水性区域大于疏水性区域，因此推测该蛋白为亲水性蛋白。

2.2.4 蛋白质磷酸化位点预测 磷酸化位点通常在苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）和赖氨酸（Tyr）3 个氨基酸残基上。预测结果显示，长白猪PPARα共有45 个磷酸化位点，其中苏氨酸残基上有15 个，分别位于4、52、71、82、129、190、200、253、279、283、285、288、307、438、450 氨基酸残基；丝氨酸残基上有25个，分别位于6、12、21、24、38、40、45、46、48、50、59、63、66、73、76、77、80、93、110、142、163、179、205、293、346 氨基酸残基；赖氨酸残基上有5 个，分别位于54、83、314、464、468 氨基酸残基。同样方法预测到50 个PPARγ磷酸化位点，其中苏氨酸残基上有14 个，分别位于 4、19、29、33、40、65、74、165、256、265、268、269、324、343 氨基酸残基；丝氨酸残基上有27 个，分别位于 8、14、25、45、50、56、58、70、71、103、111、116、185、225、226、235、248、252、272、281、359、369、382、409、421、456、491 氨基酸残基；赖氨酸残基上有9个，分别位于77、101、115、150、249、326、354、500、504 氨基酸残基。糖基化位点修饰分为两种，即O 端和N 端糖基化位点，利用在线软件NetOGlyc3.1和NetNGlyc1.0 分析O 端和N 端糖基化位点发现，长白猪PPARα共有14 个O 端糖基化位点，分别位于4、63、69、71、73、76、80、82、93、95、196、179、234 氨基酸残基，没有检测到N 端糖基化位点，长白猪PPARγ共有18 个O 端糖基化位点分别位于14、19、25、29、71、103、111、116、119、130、203、235、248、265、268、269、272 和295 氨基酸残基，检测到23 位氨基酸残基处有1 个N 端糖基化位点。

2.2.5 蛋白质三级结构预测 对长白猪的PPARα、PPARγ编码蛋白质的三级结构进行建模（图2），可以看出2种蛋白的三级结构总体十分相似，但2 种蛋白的氨基酸总数存在区别，在三级结构也存在不同，文中用红色标记出两者的不同。从三级结构中发现2 种蛋白α螺旋和无规卷曲占比例较高，与二级结构预测的结果一致。PPARα在99～173 位氨基酸残基为DNA 结合结构域，PPARγ的135～209 位氨基酸残基为DNA 结合结构域，两者该结构域相似性82.67%。PPARα在239～466 位氨基酸残基为配体结合结构域，PPARγ的237～502 位氨基酸残基为配体结合结构域，两者该结构域相似性64.04%。

图2 长白猪PPARα 和PPARγ 蛋白质三级结构预测

2.2.6 长白猪与其他物种系统进化树构建 对8 个物种的PPARα、PPARγ蛋白质氨基酸序列进行同源性比较，并建立系统进化树。如图3-A 显示，猪的PPARα蛋白质氨基酸序列与牛和山羊的亲缘关系较近，其次为小鼠和人，与绿头鸭和鸡的亲缘关系最远，山羊、牛和猪同属于偶蹄目，由此说明该蛋白在进化过程中较为保守。PPARγ蛋白质氨基酸序列的亲缘关系与PPARα不同，猪的该蛋白与人、猕猴和小鼠的亲缘关系较近，与山羊和牛的亲缘关系次之，与绿头鸭和鸡的亲缘关系最远（图3-B），由于该蛋白的氨基酸序列在跨越不同的目和科，在保守性方面较PPARα差。

图3 长白猪PPARα 和PPARγ 与其他物种氨基酸系统进化树

将猪PPARα序列与其他各物种序列比较发现（图4），猪与牛的同源性最高，为94.9%，其次为山羊94.7%，与进化树关系所得结果一致。将猪PPARγ序列与其他各物种序列比较发现（图5），猪与人的同源性最高，为98.5%，其次为猕猴和小鼠，分别为98.2%、98.1%，与进化树关系所得结果一致。

2.3 长白猪PPARα、PPARγ基因的组织表达谱 如图6-A所示，PPARα在长白猪的肝脏中表达量最高，其次为肾脏、脂肪组织和胃，脾脏的表达量最低，该基因在这些组织的表达量较其他组织均达到差异极显著水平；其他各组织均有表达。由图6-B 可知，PPARγ在长白猪的脂肪组织中表达量最高，胃中表达量次之，该基因在这2种组织中表达量与其他组织达到极显著差异水平；其他各组织表达量较低且种间未达到差异极显著水平。

图4 不同物种PPARα 序列差别（下三角）和相似性（上三角）

图5 不同物种PPARγ 序列差别 (下三角) 和相似性 (上三角)

图6 长白猪PPARα 和PPARγ 基因在各组织中的表达量

3 讨 论

本研究成功克隆了长白猪的PPARα、PPARγ基因，测序PPARα基因CDS 区全长为1 407 bp，编码468 个氨基酸；PPARγ基因CDS 区全长1 515 bp，编码504个氨基酸，克隆得到的序列与GenBank 数据库中的猪PPARα、PPARγ序列一致。通过亲缘关系分析，发现PPARα、PPARγ的保守性都很强，该结果与在广西巴马小型猪中研究结论一致[20]。目前对不同品种猪中这2种基因有效遗传变异位点的研究尚未报道，在后续的研究中通过扩大样品量筛选有效的遗传标记，为猪育种工作提供依据。

对两基因序列进行生物信息学分析的结果显示，长白猪PPARα、PPARγ2 种蛋白二级结构以α螺旋和无规卷曲为主，与三级结构预测结果一致。这2 种蛋白均不含有跨膜结构域，为亲水性蛋白，该预测结果与2 种蛋白作为转录因子调控特异性基因的转录表达相符合，因为它们发挥功能时首先转移至细胞核，而非与膜结构相结，同时对其保守结构域分析发现，长白猪PPARα、PPARγ均由DNA 结合结构域和配体结合结构域，且同源性较高。PPAR 属于核受体家族成员，其活性受到多种翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、泛素化和类泛素化等多种形式[21-22]。本研究在蛋白质翻译后修饰预测中也发现2 种蛋白含有多个磷酸化位点和一些糖基化位点。

本研究采集了长白猪12 个不同部位的组织样品，通过qT-PCR 技术检测PPARα、PPARγ的表达量，发现PPARα基因在肝脏中高表达。饶辽源等[23]研究证明PPARα主要在山羊的肾脏和肝脏中表达较高。另有报道PPARα在不同品种猪、不同周龄猪的肝脏组织表达水平存在差异[21]，提示该基因存在物种差异和时序性。本研究发现，PPARγ基因在脂肪组织中表达量最高，这与江口萝卜猪、从江香猪和八眉猪各组织中PPARγ基因表达量的结果一致[24-25]，且随着喂养月龄的不同呈上升趋势，但广西巴马小型猪发现PPARγ基因在大肠组织中表达量最高[20]，该结果表明PPARγ基因在不同的猪品种之间存在表达差异，可能与广西小型猪特殊的形体有关。另外，在不同冷刺激下PPARγ基因表达量也有不同[26]，提示该基因能量平衡方面具有重要作用。同时，张青青等[27]在黄牛中的研究结果也显示，在脂肪组织分化的不同时间点PPARγ基因的表达量不同，这些数据说明该基因在脂肪组织中具有重要功能。

4 结 论

本研究成功克隆了长白猪PPARα和PPARγ的CDS序列，其核苷酸序列长度分别为1 407 bp 和1 515 bp，随后构建了真核表达载体；2 种蛋白主要二级结构为α螺旋和无规卷曲，为亲水蛋白且保守性较强；PPARα在长白猪的肝脏中表达量最高，脾脏的表达量最低，PPARγ在长白猪的脂肪组织中表达量最高，胃中表达量次之，提示2 种基因在机体能量代谢方面发挥作用。