不同兽药抗生素对益生菌的抑制作用研究

蓝俊虹，张 冰，许英蕾，王永侠，范小燕，杨彩梅*

(1.浙江农林大学动物科技学院，浙江临安 311300；2.浙江惠嘉生物技术股份有限公司，浙江安吉 313300)

抗生素可促进动物生长，防治动物腹泻，进而提高生产性能和养殖效益，因此被广泛使用。但随着抗生素大量使用甚至滥用，其负面影响越来越突出，甚至威胁到食品安全和人类健康。据中国农业农村部194 号公告，从2020 年1 月起，我国禁止饲料中添加中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。

益生菌作为一种绿色饲料添加剂，已被广泛应用于畜禽养殖。我国农业农村部发布的《饲料添加剂品种目录》可使用的饲用微生态制剂有34 种，包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、酵母菌等。大量研究表明，益生菌具有调节畜禽肠道菌群，增强畜禽机体免疫力和抗应激能力，提高饲料转化率等作用[1-3]。抗生素尽管在饲料添加剂中禁用，但在兽药治疗中依然可以使用。由于益生菌产品是活菌制剂，治疗过程中抗生素药物的添加与使用是否会对益生菌造成影响也一直是畜禽养殖中关注的问题，但是目前关于不同抗生素参与益生菌的抑制作用方面的研究较少。本试验采用8 种兽药用抗生素类物质，通过牛津杯双层平板扩散试验研究这些抗生素不同浓度下对5 种常用益生菌的抑制作用，为益生菌的合理利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验菌种与抗生素 试验菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CGMCC9383]、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[CGMCC9385]、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）[CGMCC9385]、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）[CGMCC93821]、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）[CGMCC3866]均购自中国普通微生物菌种保藏中心。

试验抗生素：杆菌肽锌（Zinc Bacitracin）、喹烯酮（Quinocetone）、吉他霉素（Guitarmycin）、盐酸金霉素（Chlortetracycline Hydrochloride）、土霉素钙（Oxytetracycline Calcium）、阿莫西林（Amoxicillin）、硫酸新霉素（Neomycin Sulfate）、硫酸粘杆菌素（Colistin Sulfate）8 种。

1.2 试验方法

1.2.1 抗生素溶液样品的配制 抗生素样品用量及溶解与稀释参照药典[4]。

杆菌肽锌溶液：分别称取0.25、0.5、0.75 g BMD样品，分别溶于按pH 6.0 磷酸盐缓冲液:吡啶:5 mol/L盐酸=31:9:20 配制的混合液中，定容至100 mL，而后用pH 为6.0 的磷酸盐缓冲液稀释并配成终浓度分别为25、50、75 mg/kg 样品溶液，另取适量pH 为6.0 的磷酸盐缓冲液作为空白溶剂对照。

喹烯酮溶液：分别称取0.25、0.5、0.75 g 喹烯酮样品，按喹烯酮（mg）:二甲基甲酰胺（mL）=2:1 溶解喹烯酮，而后加甲醇稀释并定容至终浓度为25、50、75 mg/kg 样品溶液，另取适量的甲醇作为空白溶剂对照。

吉他霉素溶液：分别称取0.25、0.5、0.75 g 吉他霉素样品，按吉他霉素（mg）:乙醇（mL）=2:1 溶解吉他霉素，而后加灭菌水定容至100 mL，而后分别用pH 为7.5 的磷酸盐缓冲液稀释配成终浓度分别为25、50、75 mg/kg 样品溶液，另取适量pH 为7.5 的磷酸盐缓冲液作为空白溶剂对照。

硫酸新霉素溶液：分别称取0.25、0.5、0.75 g 硫酸新霉素样品，加灭菌水溶解，并稀释定容至终浓度为25、50、75 mg/kg 样品溶液，另取适量灭菌水作为空白溶剂对照。

阿莫西林溶液：分别称取0.25、0.5、0.75 g 阿莫西林样品，分别溶于按0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（pH为5.0）:乙腈=39:1 配制的溶剂中，并稀释定容至终浓度为25、50、75 mg/kg 样品溶液，另取适量该溶液溶剂作为空白对照。

土霉素钙溶液：分别称取0.5、1.0、1.50 g 土霉素钙样品，加pH 为6.0 的磷酸盐缓冲液溶解，并稀释定容至终浓度为50、100、150 mg/kg 样品溶液，另取适量pH 为6.0 的磷酸盐缓冲液作为空白溶剂对照。

盐酸金霉素溶液：分别称取0.5、1.0、1.50 g 盐酸金霉素样品，加0.01 mol/L 盐酸溶液中溶解，并稀释定容至终浓度为50、100、150 mg/kg 样品溶液，另取适量0.01 mol/L 盐酸溶液作为空白溶剂对照。

硫酸粘杆菌素溶液：分别称取0.5、1.0、1.50 g 硫酸粘杆菌素样品，具体配置方法同土霉素钙溶液。

1.2.2 培养基的配制 Luria-Bertani（LB）固体培养基：准确称取胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水定容至950 mL，调节pH 至7.0，再用蒸馏水定容至1 L，121℃灭菌30 min 备用。

强化梭菌（RCM）固体培养基：准确称取强化梭菌培养基37.5g（成品，购自杭州百思生物技术有限公司，产品编号：BS1068），琼脂17 g，加蒸馏水1 L，pH 约为7.4，121℃灭菌30 min 备用。

乳酸细菌（MRS）固体培养：准确称取MRS 琼脂培养基66.2 g（成品，购自青岛高科园海博生物技术有限公司，产品编号：HB0384），琼脂7.5 g，加蒸馏水1 L，调节pH 至6.2～6.6（灭菌后6.0～6.5），121℃灭菌25 min 备用。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基：准确称取马铃薯葡萄糖琼脂培养基46 g（成品，购自杭州百思生物技术有限公司，产品编号：BS1123），琼脂5 g，自来水1 L，自然pH，121℃灭菌30 min 备用。

1.2.3 菌种的活化 分别挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌于LB 固体培养基斜面上划线接种；丁酸梭菌于RCM 固体培养基斜面上划线接种；粪肠球菌于MRS 固体培养基斜面上划线接种；酵母菌于PDA 固体培养基斜面上划线接种。37℃培养48 h（丁酸梭菌于厌氧罐中培养），用无菌水洗脱备用。保证各菌液菌数含量为109CFU/mL。

1.2.4 牛津杯双层平板扩散试验 参照参考文献[5-6]的方法。待已配置的LB、RCM、MRS、PDA 固体培养基冷却至适当的温度，无菌条件下向已灭菌的培养皿（90 mm）加入15～20 mL 各培养基进行封底，待第一层培养基充分冷却凝固后，分别用灭菌移液器吸取已调好的供试菌0.1 mL，加入50～60℃ 100 mL 相对应的培养基中（即0.1% 的加菌量），混合均匀后，加入5～7 mL 含菌液的各固体培养基到对应冷凝好的培养基表面，使菌液分布均匀。待第二层培养基完全冷却凝固后，用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯（φ6×8×10 mm）置于培养基表面，按一定顺序加入适当量的样品溶液。而后放入37℃恒温培养箱18～24 h（丁酸梭菌则是置于厌氧罐中，37℃恒温培养箱18～24 h）。最后用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

根据抑菌圈直径结果的判定标准[7-8]进行抑菌能力判定：抑菌圈直径大于20 mm 为抑菌作用极强，直径15～20 mm 为抑菌作用较强；直径 10～15 mm 为中度抑菌作用；直径为7～9 mm 为抑菌作用较弱；抑菌圈直径＜7 mm 为无抑菌作用；直径越大，抑菌能力越强。

1.3 统计分析 所有试验均至少重复3 次。所得结果图（除特别标注外）与表均按照图示进行测量与读取。采用SPSS 22.0 软件进行数据单因素方差分析（One-Way ANOVA）。所得数据均以平均值±标准差表示。

2 结果及分析

从图1 以及表1 可以看出，试验所用不同浓度的杆菌肽锌、硫酸粘杆菌素以及25 mg/kg 喹烯酮对枯草芽孢杆菌均无抑制作用；50 mg/kg 土霉素钙抑制作用较弱；50、75 mg/kg 的喹烯酮，100 mg/kg 和150 mg/kg的土霉素钙，50、100、150 mg/kg 的盐酸金霉素对枯草芽孢杆菌有中度的抑制作用；25、50、75 mg/kg 的吉他霉素、阿莫西林以及硫酸新霉素对枯草芽孢杆菌抑制作用极强。

图1 不同抗生素对枯草芽孢杆菌抑制作用

表1 不同抗生素对枯草芽孢杆菌抑制作用的测定结果 mm

图2 及表2 表明，不同浓度的杆菌肽锌、硫酸粘杆菌素以及25 mg/kg 喹烯酮对地衣芽孢杆菌均无抑制作用；50 mg/kg 和75 mg/kg 的喹烯酮、25 mg/kg 的硫酸新霉素、不同浓度盐酸金霉素以及土霉素钙对地衣芽孢杆菌有中度抑制作用，50 mg/kg 硫酸新霉素的抑制作用较强，75 mg/kg 的硫酸新霉素则具有极强的抑制作用；吉他霉素对地衣芽孢杆菌的抑制作用明显，25 mg/kg 的吉他霉素有较强的抑制作用，50 mg/kg 与75 mg/kg 吉他霉素表现出极强的抑制作用。此外，不同浓度的阿莫西林显示出较强的抑制作用。

图2 不同抗生素对地衣芽孢杆菌的抑制作用

表2 不同抗生素对地衣芽孢杆菌抑制作用的测定结果 mm

图3 及表3 表明，不同浓度的杆菌肽锌、硫酸新霉素以及硫酸粘杆菌素对丁酸梭菌无抑制作用；25 mg/kg和50 mg/kg 吉他霉素具有较强的抑制作用，75 mg/kg吉他霉素的抑制作用极强；不同浓度喹烯酮、盐酸金霉素、土霉素钙以及阿莫西林对丁酸梭菌均显示极强的抑制作用。

图3 不同抗生素对丁酸梭菌的抑制作用

图4 及表4 表明，不同浓度的杆菌肽锌、喹烯酮、硫酸新霉素、硫酸粘杆菌素均对粪肠球菌无抑制作用；25 mg/kg 吉他霉素有中度抑制作用，但50 mg/kg 和75 mg/kg吉他霉素有较强的抑制作用；3 个不同浓度的阿莫西林有较强的抑制作用；所用不同浓度盐酸金霉素以及土霉素钙对粪肠球菌抑制作用极强。

表3 不同抗生素对丁酸梭菌抑制作用的测定结果 mm

图4 不同抗生素对粪肠球菌的抑制作用

表4 不同抗生素对粪肠球菌抑制作用的测定结果 mm

图5 表明，试验所用的不同浓度的抗生素类物质，包括杆菌肽锌、喹烯酮、吉他霉素、盐酸金霉素、土霉素钙、阿莫西林、硫酸新霉素以及硫酸粘杆菌素对酵母菌均有抑菌作用。

3 讨 论

图5 不同抗生素对酵母菌的抑制作用

抗生素长期以来一直用于动物生产，以提高生产性能，预防疾病的发生，但抗生素在大量使用的同时也带来一系列弊端，如动物胃肠道正常菌群失调、耐药性和药物残留等。研究表明，益生菌可通过调节肠道菌群进而提高畜禽自身免疫力，或是改善抗生素使用后带来的一系列肠道菌群失调的症状，可部分或全部替代抗生素[9]。王二柱等[10]研究发现，枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酪杆菌与粪肠球菌按照4:1:4:1 组合与低剂量的金霉素配合，可达到高浓度金霉素的抑菌效果。Wang 等[11]研究也表明，与金霉素相比，益生菌制剂提高动物免疫力的效果更好。

有研究表明，丁酸梭菌具有很强的耐受性，对常用的抗生素药物，包括杆菌肽锌、青霉素、链霉素等在内的多种抗生素不敏感[12]。本试验结果显示，不同浓度的杆菌肽锌及硫酸粘杆菌素对包括丁酸梭菌在内的5 种常用益生菌对均无抑菌作用。硫酸粘杆菌素则主要对革兰氏阴性菌（尤其大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、变形杆菌和嗜血杆菌等）有强抑制作用，用于治疗革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。刘超齐等[13]研究显示，饲料中添加 300～400 mg/kg 硫酸粘杆菌素会对枯草芽孢杆菌产生抑制作用，当添加剂量低于200 mg/kg 时，则对枯草芽孢杆菌无抑制作用。甄丽等[14]研究表明，乳酸菌对常规用量浓度的硫酸粘杆菌素、土霉素等抗生素的敏感性不强。邬向东等[15]研究显示，乳酸粪肠球菌对杆菌肽锌及硫酸黏杆菌等抗生素有较强的耐受作用，其最小抑菌浓度分别达到了2 560、160 mg/kg。本试验所用的粪肠球菌属于乳酸菌中的一类，结果表明不同浓度的杆菌肽锌、喹烯酮、硫酸新霉素、硫酸粘杆菌素均对粪肠球菌无抑菌作用。同时，冯柳柳等[16]研究表明，对比于单个菌株，乳球菌、乳杆菌、枯草芽孢杆菌3 种菌株的混合使用提高了其对硫酸新霉素与硫酸粘杆菌素的耐受性。酵母菌属于真菌，其对大多数抗生素（如氨苄青霉素，链霉素，新霉素等）不敏感[17-18]，啤酒酵母也能够耐受饲料中添加的抗生素[13]，说明抗生素的使用不影响酵母菌的生物活性。本研究结果显示，喹烯酮、吉他霉素、土霉素钙等8 种抗生素均对酵母菌无抑制作用。

4 结 论

本试验结果显示，不同浓度的吉他霉素、阿莫西林以及硫酸新霉素均对枯草芽孢杆菌显示出极强的抑制作用；50 mg/kg 吉他霉素及75 mg/kg 硫酸新霉素对地衣芽孢杆菌有着极强的抑制作用；75 mg/kg 吉他霉素、不同浓度喹烯酮、盐酸金霉素、土霉素钙以及阿莫西林对丁酸梭菌的抑制作用极强；不同浓度盐酸金霉素以及土霉素钙对粪肠球菌抑菌作用极强。为了更好发挥益生菌制剂的作用，在畜禽饲养过程应避免与能破坏益生菌制剂活性的抗生素共同使用，以减少抗生素对益生菌的影响。