复合氨基酸对断奶仔猪免疫和肠道能量、氨基酸水平的影响

李思源 ，朱哲坤，王 倩，田俊杰，孟禹璇，郭双双,2，王 蕾,2，赵 迪,2，李宝成，侯永清,2*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023）

当下我国仔猪普遍采用规模化、集约化养殖。仔猪早期断奶因其具有多种优点，被大多数养殖场所采用。在仔猪断奶的早期阶段，其消化系统和免疫器官发育不完善，易受到外界不良因素的影响产生应激[1]，引发仔猪腹泻、免疫力减弱、肠道损伤、能量代谢紊乱、氨基酸代谢吸收水平降低等一系列问题[2-3]，从而威胁仔猪的健康，影响养猪业的生产效益。功能性氨基酸可参与并调节仔猪关键代谢途径[3]，合成防御分子调节机体免疫，参与小肽、含氮含硫代谢物的生成[4]，参与调控三大营养物质的代谢，影响体内氨基酸水平等[5]。目前研究较多的功能性氨基酸有精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、色氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸等[4-5]。

目前，国内外关于功能性氨基酸在缓解仔猪断奶应激方面的研究较多[6]，但关于断奶仔猪日粮中添加功能性氨基酸复合物的研究鲜见报道。基于功能性氨基酸之间可能存在协同作用[7]，本研究团队前期研究表明，添加1.00% 复合氨基酸可显著降低仔猪腹泻率，促进肠黏膜生长[16]。本试验旨在研究复合氨基酸对断奶仔猪免疫功能以及肠道能量和氨基酸水平的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 谷氨酸（G103978，99%）、谷氨酰胺（G105425，99%）、精氨酸（A108220，98%）、甘氨酸（A111465，≥99%）、N-乙酰半胱氨酸（A105420，99%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。根据前期试验研究结果确定谷氨酸:谷氨酰胺:甘氨酸:精氨酸:N-乙酰半胱氨酸复合氨基酸的组成和比例为10:4:4:2:1[16]。

1.2 试验动物与试验设计 选用16 头（21±3）日龄、体重（4.83±0.16）kg 的杜× 长× 大断奶仔猪，随机分成2 个处理组（对照组和试验组），每个处理8 个重复，每个重复1 头猪。对照组和试验组分别在基础日粮中添加0.99%丙氨酸（与试验组等氮）和1.00%复合氨基酸。试验期为21 d，在试验结束时屠宰取样。

1.3 试验日粮与饲养管理 基础日粮参照 NRC（2012）猪的营养标准配制，其组成及营养成分见表1。

试验期间猪舍全封闭，进猪前对猪舍和猪笼进行全面清洗和消毒。仔猪在不锈钢试验笼中饲养，每笼2 只猪，笼子用挡板隔开，分别饲喂。试验期间保持猪舍通风良好，室温维持在22～25℃。自由采食和饮水，定时清扫和消毒猪舍，保持猪舍干净卫生。

1.4 样品采集 于试验21 d 早上，将空腹仔猪称重，然后用添加EDTA 抗凝剂的采血管于仔猪前腔静脉采血，置于冰上待测。采血后，肌肉注射戊巴比妥钠（50 mg/kg BW）将仔猪进行麻醉，15 min 后屠宰。打开腹腔在空肠、回肠中段各取10 cm，刮取肠黏膜，液氮速冻后，保存于-80℃冰箱待测。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 生长性能测定 试验期间详细记录每头仔猪每天的喂料量以及腹泻情况。分别于试验的第1、14、21 天对仔猪进行空腹称重。计算1～14 d 与15～21 d 仔猪的平均日增重、平均日采食量、耗料增重比以及腹泻率。

1.5.2 血细胞分类计数 采用德国Siemens ADVIA®2120i全自动血球分析仪对血液进行分类计数。检测白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞的数量、血红蛋白含量、平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度变异数、血小板含量、血小板平均体积。

1.5.3 回肠黏膜免疫相关基因的相对表达量分析 回肠黏膜中总RNA 使用RNAiso Plus 试剂盒并参照其说明书方法进行提取。在保证RNA 浓度和纯度合格（A260/A280=1.7～2.1，且A260/A230＞2.0）且未降解条件下，根据PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒的方法进行反转录，合成cDNA 后使用SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseHPlus） 进行Real-time PCR。以上所用到的试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。检测的免疫相关基因为白细胞介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、干扰素（Interferon，IFN）-α、IFN-β、IFN-γ、趋化因子（C-C 基序） 配体2（C-C motif chemokine ligand-2，CCL2）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、干扰素诱导蛋白-1（Interferninduced protein-1，IFIT1）、黏病毒抗性蛋白-1（Myxovirus resistance-1，MX1）。基因的引物序列见表2。基因的相对表达量计算参照Fu 等[8]的方法进行分析。

表1 基础日粮组成与营养成分（风干基础）

1.5.4 空肠黏膜能量状态的测定 称取100～200 mg 空肠黏膜研磨样，置于预冷的玻璃匀浆器中，加入2 mL预冷1.5 mol/L 高氯酸，冰浴匀浆，然后离心（4℃，3 000 g/min，10 min），取上清液1 mL 缓慢加入0.4 mL 2 mol/L 碳酸钾溶液中和，再离心（4℃，3 000 g/min，10 min），取上清液用高效液相色谱仪（Waters，美国）进行测定。

表2 基因引物序列

根据洗脱峰面积和标准品浓度，计算空肠黏膜三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）、单磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate，AMP）的含量，结果以μg/g 黏膜重表示，并根据公式计算腺苷酸池（Total Adenosine pool，TAN）、能荷（Energy Charge，EC）、AMP/ATP 值。TAN=ATP+ADP+AMP；EC=（ATP+1/2ADP）（/ATP+ADP+AMP）。

1.5.5 空肠黏膜游离氨基酸的测定 准确称取空肠黏膜组织样品150 mg，加1 mL 3%磺基水杨酸溶解。充分涡旋混匀，10 000 r/min 离心15 min，取上清液用锂盐样品稀释液进行稀释，再用0.22 μm 孔径滤膜过滤，用德国SYKAM S-433D 型氨基酸分析仪对滤液中的氨基酸含量进行检测。

1.6 统计分析 试验数据使用平均值±标准差表示。采用SPSS 22.0 统计软件进行独立样本t 检验分析。以P＜0.01为差异极显著性判断标准，以0.01 ≤P＜0.05 为差异显著判断标准，以0.05 ≤P＜0.1 为具有差异显著性趋势。

2 结果与分析

2.1 复合氨基酸对断奶仔猪生长性能的影响 由表3 可知，与对照组相比，试验组降低了1～14 d 和15～21 d断奶仔猪的腹泻率（P＜0.05）；有降低15～21 d 断奶仔猪耗料增重比的趋势（P=0.054）。复合氨基酸对各阶段平均体重、平均日采食量与1～14 d 耗料增重比无显著影响。

表3 复合氨基酸对断奶仔猪生长性能的影响（n=8）

2.2 复合氨基酸对断奶仔猪血细胞分类计数的影响 由表4 可知，与对照组相比，试验组仔猪血液中白细胞、单核细胞的水平显著降低，极显著提高了血红蛋白含量；有降低血液嗜碱性粒细胞含量的趋势（P=0.064）。复合氨基酸对其他各项血细胞指标无显著影响。

表4 复合氨基酸对断奶仔猪血细胞计数的影响（n=8）

2.3 复合氨基酸对断奶仔猪回肠黏膜免疫相关基因表达量的影响 由表5 可知，与对照组相比，试验组仔猪回肠IFN-β和IFN-γ的基因相对表达量极显著升高；MX1和IFIT1基因的相对表达量极显著下降。复合氨基酸对IL-1β、IL-6、CCL2、TNF-α、IFN-α的基因相对表达量无显著影响。

表5 复合氨基酸对断奶仔猪回肠黏膜免疫相关基因表达量的影响（n=8）

2.4 复合氨基酸对断奶仔猪空肠黏膜能量状态的影响 由表6 可知，与对照组相比，试验组仔猪空肠黏膜TAN 水平显著升高，有提高空肠AMP 和ATP 的趋势（P=0.081，0.058）；复合氨基酸对空肠ADP 含量、AMP/ATP、EC 无显著的影响。

表6 复合氨基酸对断奶仔猪空肠黏膜能量状态的影响（n=8）

2.5 复合氨基酸对断奶仔猪空肠游离氨基酸含量的影响由表7 可知，与对照组相比，试验组仔猪空肠精氨酸与瓜氨酸的含量显著升高；复合氨基酸对其他氨基酸水平没有显著影响。

3 讨 论

3.1 复合氨基酸对断奶仔猪生长性能的影响 功能性氨基酸可以提高断奶仔猪的生长性能，增强营养物质消化吸收能力改善其健康状况[5]。既往研究表明，谷氨酰胺添加量在1.0%左右[3]、谷氨酸添加量在1.3%～1.5%或2.6%～2.9%时对35 日龄仔猪生长性能的提升与腹泻的改善较为明显[9]。印遇龙等[10]研究发现，低浓度精氨酸能够提高断奶仔猪的生长性能、降低腹泻率，可有效缓解断奶应激。本试验各功能性氨基酸的添加量相对较低，因此对断奶仔猪生长性能的改善作用不显著，但是有效降低了腹泻率。

表7 复合氨基酸对断奶仔猪空肠游离氨基酸含量的影响（n=8） nmol/mg

3.2 复合氨基酸对断奶仔猪血细胞计数的影响 血液是机体重要的免疫场所，血液中有多种血细胞主要通过分泌细胞因子发挥免疫保护作用。白细胞是机体内参与体液免疫的一类重要的功能性免疫细胞，由淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞组成。正常情况下，各种免疫细胞比例处于动态平衡，当机体发生炎症或者其他疾病时都可能引起免疫细胞数量的变化[11]。血红蛋白在氧含量高的地方容易与氧结合，在氧含量低的地方又容易与氧分离，因为这一特性使得红细胞具有了运输氧的功能。当仔猪血红蛋白浓度低于90 g/L 时即可判定为贫血，因此其浓度的高低也可反映出机体的抵抗能力[12]。研究表明，日粮中添加1.0%谷氨酰胺可有效降低血液中的白细胞与单核细胞的含量[13]；添加60 mg/kg 甘氨酸络合物可以升高血液中血红蛋白的含量，预防仔猪贫血、提高免疫力[14]。而本试验发现，日粮中添加1.00%复合氨基酸有效降低了断奶仔猪血液中白细胞、单核细胞与嗜酸性粒细胞的含量，提高了血红蛋白的含量，这表明此种复合氨基酸可以有效降低断奶仔猪的炎症反应和贫血，增强了免疫力。

3.3 复合氨基酸对断奶仔猪回肠黏膜免疫相关基因表达量的影响 IFN-β是抗病毒活性最强的药物，它可以诱导一系列干扰素刺激因子的表达，通过干扰病毒的复制和转录来抑制其蛋白的翻译，从而增强免疫发挥抗病毒的效果[15]。前期研究表明，此种功能性氨基酸复合物可以显著提高仔猪空肠IFN-β基因的相对表量[16]，与本次试验在回肠中IFN-β基因的相对表量变化趋势一致。IFN-γ是二型干扰素，有很强的免疫调节功能，主要由T 细胞与NK 细胞分泌的可溶性蛋白糖构成，可提高机体的抗感染能力[17]。饲料中添加0.8%精氨酸可显著上调冷应激仔猪IFN-γ基因的表达量[17]。本试验精氨酸的添加量约为0.1%，但试验结果却与之相一致。MX1 与IFIT 家族分子是在正常情况下表达量低，但机体炎症反应的条件下受到LSP、外源双链RNA、病毒等刺激时会强烈表达[18-19]。方义军等[20]研究表明，IFIT1 是通过DNA 信号通路负反馈上调了IFN-β的表达，从而对病毒入侵发挥了保护作用。本试验日粮中添加1.00%复合氨基酸提高了回肠黏膜IFN-β、IFN-γ基因的相对表达量，降低了MX1、IFIT1基因的相对表达量，说明添加此种复合氨基酸提高了断奶仔猪免疫能力，降低了断奶应激引起的炎症反应。

3.4 复合氨基酸对断奶仔猪空肠黏膜能量的影响 ATP是机体内直接用于做功的能量物质，在生物体内能量交换中起着至关重要的作用，正常状态下体内约80% 的ATP 在线粒体中产生，然后供应到全身各处，为细胞各种生理功能提供必需的能量。TAN 的大小可以反映线粒体生成高能磷酸化合物的能力，同时也显示了细胞的储存能量的状态[21]。谷氨酸可以与草酰乙酸通过转氨基产生α-酮戊二酸和天冬氨酸，α-酮戊二酸进入线粒体参与三羧酸循环产生ATP。秦琴等[22]研究发现，日粮添加2.00%谷氨酸可以参与调节小肠的能量代谢相关通路，为肠道完整性和维持功能提供能量。谷氨酰胺是免疫细胞重要的能源物质，日粮中添加1.00%谷氨酰胺能够促进巨噬细胞和淋巴细胞的增殖和分化，利用碳链并氧化成ATP 为小肠细胞供能[23]。日粮中添加1.20‰ N-乙酰半胱氨酸能够参与机体的糖代谢与三羧酸循环，促进宫内发育迟缓仔猪小肠ATP 的生成，为小肠补充能量[24]。AMP 亦存在一种环状结构称为环-单磷酸腺苷（cAMP），ATP 在某些细胞中可以在腺苷环化酶的催化下成为cAMP。cAMP 是介导激素作用的“第二信使”，参与了动物体内各种酶活以及生长因子的代谢过程[23]。本试验所用方法检测的AMP 中可能存在有cAMP，故AMP 的升高。本试验日粮中添加1.00%复合氨基酸，在各种氨基酸成分比例较低的基础上，仍提高了断奶仔猪空肠的ATP、AMP 与TAN，说明日粮中添加1.00%复合氨基酸能够增加肠道的能量储备。

3.5 复合氨基酸对断奶仔猪空肠游离氨基酸的影响 氨基酸作为机体免疫系统的基本单元，对维持机体免疫功能、抵抗与消除疾病有重要作用[5]。伍国耀[25]研究表明，精氨酸内源合成主要通过小肠-肾代谢轴完成，幼年动物精氨酸主要在小肠中合成。对仔猪来说，精氨酸是一种必需氨基酸，对生长免疫有重要作用，可以在小肠内被分解利用，进入细胞后在酶的作用下降解，产生一氧化氮、鸟氨酸、多胺、脯氨酸等[26]。精氨酸通过Arg-NO-HSP70 途径维护肠道健康，促进小肠黏膜生长[27]，在日粮中添加0.5%～1.0% 精氨酸可以防止肠道功能障碍，促进肠黏膜生长[28]。瓜氨酸在精氨酸琥珀酸合成酶与精氨酸琥珀酸裂解酶作用下转化成精氨酸，在这个过程中每合成一分子精氨酸需要2 个ATP[26]。张莉莉等[29]研究发现，口服精氨酸可显著提高小肠精氨酸代谢相关氨基酸的水平，缓解宫内发育迟缓仔猪的肠道内源精氨酸合成不足，发挥肠道营养作用。本研究结果显示，日粮中添加1.00%复合氨基酸提高了空肠精氨酸和瓜氨酸的含量，这可能与其提高空肠ATP 水平有关，能量储备的增加有利于内源精氨酸的合成。

4 结 论

本研究结果表明，日粮中添加1.00% 复合氨基酸可以有效降低断奶仔猪的腹泻率，这可能与其提高仔猪免疫力，增加肠道能量储备和精氨酸水平有关。