鸡性别偏移相关基因筛选的研究

樊庆灿

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000）

性别比指的是出雏个体中的雄雌比例[1]，这对家禽的工业化生产极为重要。在家鸡（Gallus gallus）生产中，若种鸡和蛋鸡中的雄性比例偏高，需要处理的雄性数目更多，用于生产的雌性个体数相应减少，就会极大地影响家禽生产效益[2]。研究发现在不同环境和饲养条件下，家禽的雌雄比例并不是理论中的1:1，母代会根据生长环境和自身状况对后代比例做出适当调整，生产出较多对生活环境适应度更好的性别后代，使其有更多的繁殖机会，从而出现性别偏移[3-4]。

与哺乳动物不同，禽类雌性染色体类型是ZW 型，卵母细胞中的性染色体决定子代性别[5]。在禽类雌性生殖细胞的减数分裂过程中，一组染色体会以极体的形式排出体外，另一组染色体会被保留并最终形成卵母细胞，这一过程决定子代性别比例[6]。目前研究认为影响禽类性别分配现象的因素有母禽的自主调节[1]、卵黄内固醇类激素比例[7]、卵黄沉积速度[8]和精子的选择[5]等，这些因素均是从卵母细胞形成及受精的外环境角度出发。由于禽类生理活动的复杂性，难以精确控制机体内环境进行深入研究。在这一方面，分子研究具有独特的优势，外环境的变化是通过特定基因表达量的变化来体现的。鸡的减数分裂发生在排卵前，Aslam等[9]利用鸡排卵前的胚盘，检测Z 和W 型配子形成过程中的基因表达差异，筛选出一些细胞周期和减数分裂有关的基因集。本研究利用其中数据（GSE59041）和生物信息技术，筛选Z 和W 卵泡胚盘差异表达基因，探讨基因功能，为其他禽类性别偏移的研究提供一些思路。

1 材料和方法

1.1 数据来源及背景 本研究所用数据（GSE59041）来自于基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GSE），由Aslam 等[9]上传，该研究利用海赛克斯褐色蛋鸡排卵前卵泡的胚盘，检测Z 和W 型卵泡减数分裂过程中的相关基因表达量[9]。本研究选择8 个样本的表达谱数据进行生物信息学分析（表1）。

表1 8 个样本信息统计表

1.2 分析软件及步骤 在GEO 数据库中查找编号GSE59041 的样品信息，下载Matrix 数据文件，根据表1 设定分组，利用R3.6.0 进行表达量数据log 转换并绘制箱线图，R 软件Bioconductor 包进行差异分析。将P＜0.01 且log FC＞1 的基因编号导入DAVID 6.8 中转化为Official Gene Symbol，将基因导入到STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=NPdugdyy2MoP&input_page_ show_search=on）中进行互作分析，将combinescore＞0.7 的互作数据导入到Cytoscape3.6.1 中，绘制基因互作图。利用Cytoscape 中cytoHubba 插件Betweenness算法筛选5 个核心基因，BINGO 插件进行基因富集分析并绘制树状图。利用DAVID 对显著基因进行基因通路分析。

2 结果

2.1 表达数据的标准化 由图1 可知，8 个样本在标准化之后，下四分之一值、上四分之一值、中位数分别为（4.36±0.02）、（9.47±0.01）、（6.61±0.00），样本数据之间差异较小，可以进行表达谱数据的差异分析。

图1 样本数据标准化后的统计信息

2.2 差异表达基因 本研究共筛选出239 个在Z 和W 型卵泡胚盘中表达差异显著的基因（P＜0.01）。Z 与W 相比，基因表达上调的基因数为191 个，下调基因数为48 个。表2 列出P＜0.000 1 的6 个基因，差异最为显著的基因为接触蛋白1（Contactin 1，CNTN1），其次为乙状同源盒（Goosecoid Homeobox，GSC）、成纤维细胞生长因子8（Fibroblast Growth Factor 8，FGF8）、纤毛和鞭毛相关蛋白74（Cilia And Flagella Associated Protein 74，CFAP74）、免疫球蛋白超家族成员21（Immunoglobin Superfamily Member 21，IGSF21）和驱动蛋白家族成员23（Kinesin Family Member 23，KIF23），CNTN1在鸡Z 型卵泡的胚盘中表达下调，另外5 个基因表达上调。利用Betweenness 算法筛选的5 个核心基因见图2，分别为合子阻滞基因1（Zygote arrest 1 like，ZAR1L）、周期蛋白依赖性激酶1（Cyclin Dependent Kinase 1，CDK1）、细胞分裂周期蛋白20（Cell Division Cycle 20，CDC20） 和RAD51 重 组 酶（RAD51 Recombinase，RAD51），这些基因间存在互作关系。

表2 P＜0.0001 的差异表达基因

图2 核心基因的互作图

图3 基因富集分析树状图

2.3 基因富集分析 对筛选到的239 个基因进行功能富集分析（图3），共筛选到3 个方向18 个显著条目（P＜0.05）：DNA 复制和装配；细胞周期；基因表达和细胞生物合成。其中DNA 复制和装配方向富集到11个条目。基因表达和细胞生物合成方向6 个条目，细胞周期方向只有1 个条目。所有条目中，DNA 构象变化（DNA Conformation Change）是P值最小的条目。细胞内生物过程调控（Regulation of Cellular Process）是基因数最多的条目（18 个）。P最小的6 个基因中，GSC基因富集在6 个条目中，FGF8基因富集在3 个条目，均属于基因表达和细胞内生物合成方向。核心基因RAD51富集在细胞周期和DNA 复制、装配方向的6 个条目中。

2.4 信号通路分析 将筛选到的基因进行信号通路分析（图4），共筛选到6 个显著信号通路（P＜0.05），其中细胞周期（04110）信号通路是P值最小且参与基因数最多的信号通路。另外5 个通路包括同源重组（03440）、间隙连接（04540）、DNA 复制（03030）、p53（04115）和范可尼贫血（03460）信号通路，参与基因数分别为5、8、5、6、5 个。核心基因CDK1参与细胞周期、间隙连接和p53 信号通路，CDC20参与细胞周期信号通路，RAD51参与同源重组和范可尼贫血信号通路。

图4 基因信号通路分析统计图

3 讨 论

3.1 差异表达基因分析 本研究筛选到239 个基因，其中191 个基因在含有Z 染色体的胚盘中表达上调。鸟类性染色体中，Z 染色体为大染色体，含有较多的基因[10]，可能在Z 型卵母细胞形成过程中需要更多基因进行协调，保障受精及胚胎发育的正常进行。富集分析发现基因主要富集在3 个方向：基因复制和装配、基因表达和细胞内生物合成、细胞周期，这与减数分裂过程也是吻合的。减数分裂过程中发生染色体复制和大量的生物合成[11]，细胞周期基因能够促进并维持卵母细胞减数分裂的正常进行[12]，这些基因在不同配子形成过程中，表达量会存在一定差异。信号通路分析中，细胞周期信号通路是参与基因数最多且最显著的通路，也说明细胞周期因子在鸡卵母细胞形成中发挥重要的调控作用，是鸡性别决定时期的调控因子，其关键基因表达量的差异可能导致性别偏移。另外一些信号通路包括DNA 重组和复制、细胞凋亡、信号传导，这与富集分析结果也是一致的。

3.2 重要基因功能分析 本研究筛选的P＜0.0001 和核心基因中，FGF8、CDC20、CDK1和ZAR1L与卵母细胞发育和细胞周期相关。FGF8基因是成纤维细胞生长因子家族中的一员，该家族基因在卵泡发育过程中具有重要的调控作用[13]。研究发现FGF8基因能激活原始卵泡[14]、促进颗粒细胞雌激素分泌和卵丘扩散[15]。该基因通过MAPK/ERK 信号传导激活并调控原始生殖细胞的发育[16-17]。基因家族成员FGF9的缺失导致大鼠胚胎性别反转[18]。CDC20基因通过激活周期体APC/C 保障有丝分裂中期到后期的有序进行，并在有丝分裂到减数分裂转换中发挥重要的作用[19]。APC/CCDC20在减数分裂Ⅰ中期、末期和减数分裂Ⅱ中期的“失活-活化-再失活”调节减数分裂的进行[20]。CDK1基因在细胞周期的G2/M 期的激活中具有重要调控作用[21]，CDK1 蛋白与CCNB1 蛋白的结合形成细胞促分裂因子（Maturation Promoting Factor,MPF），促进生殖细胞的减数分裂和配子的形成[22]。CDC20基因和CDK1基因参与动物卵母细胞减数分裂的调控，其表达差异可能对禽类性别偏移发挥一定的作用，但目前并未有相关报道。

ZAR1L与ZAR1基因高度同源，尤其是C 末端RNA结合域序列。ZAR1基因是母性效应基因，即母体基因转录的mRNA 储存在生殖细胞中，在胚胎基因激活前调节卵母细胞减数分裂、配子生成和早期胚胎发生[23]。在小鼠中，ZAR1-/-雌鼠不孕，胚胎发生在1-细胞期受阻[24]。在卵母细胞减数分裂成熟过程中，ZAR1基因和ZAR1L基因通过调节母细胞mRNA 翻译激活而发挥作用，ZAR1/ZAR1L基因缺失的小鼠卵母细胞中母源基因蛋白合成减少，减数分裂恢复延迟和纺锤体形成异常发生率较高[25]。另有研究发现，缺少ZAR1的雌性斑马鱼，透明带糖蛋白过量积累引起卵母细胞凋亡，性别反转为雄性[26]。Zar1基因和Zar1L基因主要在鸡的卵母细胞、胚胎和成年鸡的性腺中共表达[27]。对于禽类来讲，母代会根据自身状况调整后代性别比例，母体效应基因是相对合理的调节方式。综上所述，ZAR1/ZAR1L 蛋白可能和CCNB1、CDK1 等细胞周期蛋白协同作用，影响禽类性别偏移。

4 结 论

本研究利用鸡Z 和W 卵泡胚盘的测序数据，筛选生殖细胞减数分裂过程中影响鸡性别偏移的基因，共发现239 个基因，主要富集在DNA 复制和装配、细胞周期、基因表达和细胞生物合成3 个方向，并参与细胞周期、基因重组、p53 和间隙连接等信号通路。基因FGF8、CDC20、CDK1和母性效应基因ZAR1L可能在鸡性别偏移中发挥一定的作用。