基于网络药理学研究通心舒胶囊治疗冠心病的作用机制

刘甜甜，陈恒文，姚魁武

冠心病是冠状动脉血氧供应减少或中断，临床可见心绞痛、心肌梗死、心肌缺血或猝死的心血管事件[1-2]。冠心病属中医“胸痹”“心痛”“心悸”“厥心痛”“真心痛”范畴。中医学认为胸痹、心痛多因阳气亏虚、寒邪凝滞、痰浊内蕴、瘀血留停导致血脉瘀滞。通心舒胶囊是临床治疗冠心病心绞痛的常用药，由川芎、丹参提取物及沙棘提取物组成，方中川芎和丹参能活血化瘀、行气止痛；沙棘健脾养胃、活血散瘀；全方共奏益气活血、散瘀止痛之功效。通心舒胶囊对气虚血瘀型冠心病具有明显疗效。目前关于通心舒胶囊对冠心病疗效的作用机制尚未见报道。本研究旨在借助网络药理学方法探讨通心舒胶囊治疗冠心病的分子机制，为临床用药提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 通心舒胶囊活性成分及其作用靶点筛选 采用中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP)搜索通心舒胶囊(川芎、丹参、沙棘)活性成分，依据口服生物利用度(DB)>30%且类药性(DL)>0.18筛选通心舒胶囊中的有效成分，并检索其作用靶点，借助Uniprot数据库和STRING数据库找到靶点蛋白相应的基因名称。

1.2 通心舒胶囊-靶点网络构建 将筛选出的化合物和靶点基因输入Cytoscape 3.7.2软件构建通心舒胶囊化合物-靶点网络[3]，并对网络进行拓扑结构分析。网络中的“节点”代表通心舒胶囊活性成分和靶基因，“边”表示通心舒胶囊活性成分与靶基因之间的关系。

1.3 通心舒胶囊-疾病靶基因蛋白相互作用(PPI)网络构建 使用DisGeNET数据库，输入关键词“冠心病”，检索冠心病相关靶基因。利用Venny 2.1.0软件绘制通心舒胶囊活性成分与冠心病相交靶标的韦恩图。将筛选得到的作用靶基因录入STRING 11.0数据库平台，得到的数据以TSV.格式导入Cytoscape 3.7.2软件，构建通心舒胶囊活性成分与冠心病靶基因PPI网络，并对PPI网络进行拓扑结构分析，选择自由度(degree)和介数中心性(betweenness centrality)都大于平均值的靶点为关键靶点。

1.4 基因富集分析 应用DAVID 6.8数据库对通心舒胶囊活性成分与冠心病PPI网络中的关键靶点进行基因本体(gene ontology，GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，依据错误发现率Benjamini<0.05筛选具有显著性差异的生物过程、分子功能及KEGG通路，绘制信号通路高级气泡图。

2 结 果

2.1 通心舒胶囊活性化合物 依据OB、DL及活性成分含量，排除重复化合物和没有作用靶点的成分，筛选出通心舒胶囊有效化合物88个，其中川芎7个，丹参59个，沙棘22个，获得相应作用靶点253个，通心舒胶囊活性成分基本信息见表1。

表1 通心舒胶囊主要活性化合物

(续表)

(续表)

2.2 通心舒胶囊活性成分-靶点网络 利用Cytoscape 3.7.2软件将通心舒胶囊中川芎、丹参、沙棘活性物质分别与作用靶点构建化合物-靶点网络，川芎化合物-靶点网络中有41个节点和92条边，degree值最高的前4个化合物是杨梅酮、川芎哚、川芎萘呋内酯、川芎嗪。详见图1。丹参化合物-靶点网络中有196个节点和1 864条边，degree值最高的前21个化合物包括木犀草素、1，2，5，6-四氢丹参酮、去氢龙胆素ⅡA、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、4-亚甲丹参新酮、亚甲基丹参醌、吡喹酮c、隐丹参酮、丹参新醌D、丹参螺缩酮内脂、脱氧隐丹参酮、二氢丹参内酯、表丹参螺缩酮内脂、异隐丹参酮、异丹参酮Ⅱ、丹参醌酚Ⅰ、丹参新酮、新隐丹参酮Ⅱ、1-甲基-8，9-二氢-7H-萘[5，6-g]苯并呋喃-6，10，11-三酮、丹参酮、丹参酮ⅡA。详见图2。沙棘化合物-靶点网络中有243个节点和1014条边，degree值最高的前12个化合物依次为槲皮素、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、儿茶素、天竺葵素、β-胡萝卜素、5，7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)铬-4-酮、黄酮、黄酮醇、(2S)-黄烷酮。详见图3。以上37个degree值较高的化合物可能是通心舒胶囊治疗冠心病的关键活性成分。

图1 川芎化合物-靶点网络

图2 丹参化合物-靶点网络

图3 沙棘化合物-靶点网络

2.3 通心舒胶囊与冠心病靶基因的PPI网络分析 将253个通心舒胶囊活性成分作用靶点与912个冠心病靶点录入在线Venny 2.1.0软件绘制韦恩图(见图4)，两者取交集后获得通心舒胶囊活性成分-冠心病作用靶点90个，将这90个靶基因录入STRING数据库，得到蛋白基因互作信息，然后导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化及网络拓扑学分析，得到通心舒胶囊对冠心病作用靶点基因PPI网络(见图5)，网络包括81个节点、466条边。由网络拓扑学分析可知，网络集聚系数为0.359，网络中心性为0.183，网络密度为0.072，网络异质性为0.759，最短路径为6 164(95%)。节点自由度值和介数中心性是描述网络节点的重要指标。图5中平均节点的degree值为5.753，平均介数中心性为0.025，大于平均degree值的节点有33个，图中黄色椭圆形节点表示大于平均degree值的蛋白基因。节点大于平均介数中心性的节点有26个，依据网络节点的degree值和介数中心性筛选出18个核心作用靶点，分别为视黄醇X受体α(RXRA)、蛋白激酶B1(AKT1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素-6(IL6)、原癌基因c-Fos(FOS)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤抑制因子P53(TP53)、趋化因子8(CXCL8)、内皮素1(EDN1)、前列环素内环氧化物合成酶2(PTGS2)、白蛋白(ALB)、整合素B3(ITGB3)、白细胞介素-4(IL4)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)、糖皮质激素受体基因(NR3C1)、细胞间黏附分子1(ICAM1)。这些核心靶点在PPI网络中起着关键作用，可能是通心舒胶囊治疗冠心病的潜在靶点。

图4 通心舒胶囊与冠心病交叉靶基因韦恩图

图5 通心舒胶囊-冠心病PPI网络

2.4 GO生物功能和KEGG通路富集分析 通过DAVID数据库分析出通心舒胶囊治疗冠心病的生物过程438个，分子功能83个。依据错误发现率Benjamini<0.05筛选出158个生物过程和38个分子功能。对生物过程中富集基因数≥10的前25项作图，涉及的主要生物过程包括调节RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、凋亡过程、炎症反应、缺氧反应、血管新生、调节一氧化氮生物合成等。详见图6。参与的分子功能主要有蛋白酶结合、锌离子结合、细胞因子活性、转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、蛋白激酶结合、生长因子活性等。详见图7。对KEGG通路富集分析，依据Benjamini<0.05及排除广泛共性通路后，筛选出通心舒胶囊治疗冠心病相关的信号通路20个，绘制气泡图。详见图8。

图6 通心舒胶囊-冠心病生物过程

图7 通心舒胶囊-冠心病分子功能

图8 通心舒胶囊-冠心病交叉基因的信号通路

3 讨 论

本研究基于网络药理学方法，采用高通量数据库平台及Cytoscape软件，构建通心舒胶囊与冠心病PPI网络，并对靶点进行生物功能和信号通路富集分析，比较系统地探讨通心舒胶囊治疗冠心病的作用机制。结果显示，通心舒胶囊治疗冠心病的关键化合物有川芎嗪、木犀草素、丹参酮、异丹参酮、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡萝卜素、黄酮、黄酮醇等。研究证实川芎嗪、丹参酮、槲皮素、沙棘黄酮等均有改善心肌缺血的功效[4-7]。说明通心舒胶囊治疗冠心病是多种活性成分共同作用的结果。信号通路富集结果提示通心舒胶囊通过作用于多条信号通路治疗冠心病，并且这些通路多数被证实与冠心病的发病机制密切相关。研究发现，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)、叉头框O(FoxO)、核因子-κB(NF-κB)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)等信号通路都参与缺血心肌损伤及凋亡过程[8-14]。本研究表明通心舒胶囊通过作用于肿瘤坏死因子(TNF)和NF-κB信号通路，抑制炎症反应，减轻氧化损伤；通过活化钙信号通路，提升胞内钙离子浓度；通过激活血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、PI3K/AKT通路，保护血管内皮，促进血管新生；以及通过作用于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和mTOR信号通路，抑制心肌凋亡，从而改善心肌缺血状态，促进心功能恢复，达到治疗冠心病目的。

本研究基于网络药理学进一步阐明了通心舒胶囊的作用机制，为后续的实验研究和临床用药指明了方向。由于网络药理学是建立在复杂的网络模型上，虽然能解释中药复方多成分、多靶点、多通路的关系，但是网络统计的一些小分子化合物及作用靶点信息存在一定的局限性、筛选活性成分的标准不统一，因此，其结果的准确性还需实验进一步验证。