不同溶剂提取黑牛肝菌中的多酚及抗氧化活性的比较研究

胡栋宝 罗丽昌 杨 猛 李 琛

（玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南玉溪653100）

牛肝菌是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的统称，因肉质肥厚，极似牛肝而得名，是名贵稀有的野生食用菌，为“四大菌王”之一，主要有白、黄、黑牛肝菌几种，除少数品种有毒或味苦而不能食用外，大部分品种均可食用。黑牛肝菌（Boletus aere⁃us），是一类营养价值很高的野生食用菌，具有抗氧化、抗菌、抗辐射、护肝、降血糖及增强机体免疫力等活性[1-4]。多酚的有效提取一直是食品领域的研究热点，目前多酚的主要提取方法有溶剂萃取法、超声提取法、微波提取法、吸附分离提取法等，而常用的提取溶剂主要有甲醇、乙醇、丙酮以及这些溶剂与水的混合溶剂等[5]。不同种牛肝菌由于化学成分的差异导致其多酚最佳提取溶剂存在差异。如徐胜平等在研究铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌多酚含量时发现60%乙醇溶液提取的多酚具有较好的抗氧化活性[6]；郭磊等发现提取美味牛肝菌多酚的最好溶剂为80%的乙醇溶液[7]。目前，有关提取溶剂对黑牛肝菌多酚的提取率及其抗氧化活性影响的研究鲜见报道。为此笔者比较蒸馏水、70%甲醇、70%无水乙醇、70%丙酮对黑牛肝菌多酚类化合物提取效果的影响，多酚抗氧化活性的差异，旨在为黑牛肝菌食用菌资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

黑牛肝菌采自玉溪市易门县，干燥粉粹备用。甲醇、乙醇、丙酮、无水碳酸钠（分析纯，四川西陇化工有限公司）；没食子酸、DPPH 自由基（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、抗坏血酸（分析纯，天津市双船化学试剂厂）；ABTS[2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐（分析纯，成都艾科达化学试剂有限公司）；福林酚（分析纯，上海金穗生物科技有限公司）；过硫酸钾、磷酸氢二钠（分析纯，天津市凤船化学试剂科技有限公司）；磷酸二氢钠、三氯化铁、铁氰化钾（分析纯，西陇科学股份有限公司）；三氯乙酸（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

JA1003 型分析天平，上海精天电子仪器；H2-16K 台式高速微量离心机，湖南可成仪器设备有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵，河南巩义市予华仪器有限责任公司；UV-2700 紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑牛肝菌不同溶剂提取物的制备

将黑牛肝菌自然晾干，粉碎，过60 目筛。准确称取0.5 000 g 黑牛肝粉末放置于锥形瓶中，分别加70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮、蒸馏水，置于超声波清洗仪中提取30 min，提取物保存备用[8]。

1.3.2 黑牛肝菌多酚含量的测定

采用酚林酚法测定黑牛肝菌多酚含量：精确称取0.005 g 没食子酸标准样品，蒸馏水溶解，定容至50 mL，得0.1 mg／mL 标准液。准确量取上述标准液（mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 于 50 mL 容量瓶中，各加30 mL蒸馏水，摇匀，再加2.5 mL福林试剂，充分摇匀，1 min之后，加入10%碳酸钠溶液7.5 mL，混匀定容，60 ℃水浴反应10 min，于760 nm 波长下测定吸光度，建立标准曲线。取0.5 mL 多酚提取液代替没食子酸溶液，按上述方法测定其吸光度并计算其多酚的含量[9]。

1.3.3 清除DPPH自由基能力的测定

称取一定量的DPPH 自由基，用无水乙醇溶解，配制成0.20 mmol/L 溶液。分别取不同质量浓度的样品2 mL与2 mL DPPH自由基溶液混匀，25 ℃水浴中保温30 min。以无水乙醇为对照，于517 nm 测定吸光值。试验重复3 次。计算黑牛肝菌提取物对DPPH自由基的清除率[9-10]：

DPPH自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中：A1，对照样吸光度值；A2，样品吸光度值。

以样品为自变量、自由基清除率为因变量作图。IC50值为清除率50%时所需的浓度，所需浓度越低，则该物质的抗氧化性越强。

1.3.4 清除ABTS阳离子自由基能力的测定

取4.00 mL ABTS 阳离子自由基溶液，置于10 mL 比色管中，分别加入1.00 mL 不同浓度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）的样品液或 VC 溶液，反应10 min。以无水乙醇为参比，调零，在734 nm处测定其吸光度A2，用无水乙醇代替样品液做空白对照[10]。试验重复3 次。计算对ABTS 阳离子自由基清除率：

ABTS阳离子自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中：A1，空白对照的吸光度；A2，样品液或VC溶液的吸光度。

以样品为自变量、自由基清除率为因变量做图，IC50值为清除率50%时所需的浓度，所需浓度越低，则该物质的抗氧化性越强。

1.3.5 铁还原能力测定

铁还原能力测定采用Oyaizu 的方法[11-12]并稍做修改。移取1.0 mL提取液加入10 mL具塞带有刻度的试管中，再加入2.5 mL 浓度为0.2 mol/L 磷酸缓冲液，1%铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀，50 ℃水浴反应20 min，冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL终止反应取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸馏水，0.1%FeCl3溶液 0.5 mL 混匀，反应 10 min，于波长 700 nm 处测定吸光度。以吸光度来表示还原能力的大小，吸光度越大，说明还原能力越强[7]。试验重复3次。

1.4 统计学分析

各项指标的数据均用Origin 8.5 软件处理作图，并采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。测量数据均以 Mean±S.D.表示，P<0.05 认为有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

没食子酸标准曲线以没食子酸含量为横坐标，760 nm 下测定的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=106.26x+0.012 8，相关系数R²=0.997 7，表明线性相关良好，可作为多酚含量测定的方法[8]。

2.2 供试四种溶剂提取物多酚的含量

分别用4种溶剂水、体积百分数70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮为提取溶剂提取黑牛肝菌中的多酚并测定其中的多酚含量，不同溶剂提取的多酚具有一定差异，其中四种不同溶剂提取的多酚含量均有显著性差异（P<0.05）。由表1 可知，体积百分数为70%丙酮溶液提取效果最佳，其次是体积百分数70%甲醇、70%乙醇，蒸馏水提取效果最差，其可能原因黑牛肝菌中的多酚物质类型属于中等极性的物质。

表1 供试四种溶剂黑牛肝菌多酚提取物的吸光度值及提取量

2.3 清除DPPH自由基能力

对DPPH 自由基清除能力的大小是抗氧化性强弱的评价指标之一[13]。由图1 可以看出，黑牛肝菌四种溶剂提取物对DPPH 自由基的清除能力都较强，其中70%丙酮溶液提取物的DPPH 自由基清除率除丙酮浓度在0.1 mg/mL 时低于70%甲醇溶液外，其余均比其他溶剂清除率要高，说明多酚抗氧化活性受提取溶剂极性大小的影响，黑牛肝菌抗氧化物质主要分布在中等极性溶剂中，在极性溶剂如水中分布最少；随着提取物多酚浓度的增加，其对DPPH 自由基的清除能力也增强，但其变化趋势逐渐趋于平缓。黑牛肝菌中的多酚是一类抗氧化性的化合物，DPPH 自由基清除能力与多酚的含量呈现出很好的正相关性[14]。IC50为半数抑制率浓度，即为自由基清除率达到50%时的浓度，其浓度越低，则该物质的抗氧化性越强。根据清除率拟合曲线，70%甲醇：y=1.816x+0.780；70% 乙 醇 ：y=1.484x+0.811 8；70% 丙 酮 ：y=0.476x+0.907 9；蒸馏水：y=1.549 5x+0.715 8；VC：y=0.815x+0.675 7，其中VC 作为对照。经线性拟合，由表2 可以看出，五种溶剂（70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮、蒸馏水、VC）提取液的IC50值分别为（0.029 9±0.003）mg/mL、（0.035 0±0.005）mg/mL、（0.024 1±0.006）mg/mL、（0.046 4 ± 0.005）mg/mL、0.032 0 ±0.002 mg/mL，即DPPH 自由基清除排序为70%丙酮>70%甲醇>VC>70%乙醇>蒸馏水，其中70%丙酮与70%甲醇提取物抗氧化活性均强于VC，说明黑牛肝菌可以作为一种寻求天然抗氧化剂的资源。

图1 清除DPPH自由基能力

表2 多酚对自由基清除率和铁离子还原能力的回归结果

2.4 清除ABTS阳离子自由基能力

与DPPH 自由基类似，供试溶剂黑牛肝菌提取物都具有较好的ABTS 阳离子自由基清除活性。其清除能力与浓度呈正相关。清除率越高说明其抗氧化活性越强。随着提取物多酚浓度的增加，其对ABTS 阳离子自由基的清除能力也增加，并且随着多酚浓度的升高其变化趋势大体逐渐趋于平缓。ABTS 阳离子自由基清除能力与多酚的含量呈现出很好的正相关性[12-15]。

ABTS 阳离子自由基与抗氧化剂反应后溶液发生褪色，溶液褪色越明显，则表明所检测物质的抗氧化能力越强。ABTS 阳离子自由基的清除能力的大小是抗氧化性强弱的评价指标之一[15]。根据清除率拟合曲线，70%甲醇：y=2.766x+0.605 2；70%乙醇：y=0.911 5x+0.644 5；70%丙酮：y=0.546x+0.751；蒸馏水：y=2.303x+0.486 7；VC：y=2.202x+0.656，其中VC 作为对照。经线性拟合，由图2 可知，不同溶剂提取物中，70%乙醇提取物的DPPH 自由基清除能力最强，当浓度在0.1 mg/mL 时，清除率为94.87%。由表2 可知，五种溶剂（70%甲醇，70%乙醇，70%丙酮，蒸馏水，VC）提取液的IC50值分别为：（0.017 4±0.008）mg/mL、（0.009 7±0.007）mg/mL、（0.023 9±0.001）mg/mL、（0.031 6±0.003）mg/mL、（0.015 6±0.004）mg/mL，不同溶剂提取液对DPPH 自由基清除率能力不同，70%乙醇>VC>70%甲醇>70%丙酮>蒸馏水，可能是由于抗氧化体系不同导致[16-18]。

图2 清除ABTS阳离子自由基能力

2.5 还原 Fe³+能力

供试溶剂提取物中多酚含量对铁离子还原能力的结果见图3。不同的吸光度代表其抗氧化性能力强弱，吸光度越大代表还原能力越强。由图3 可知，吸光度与多酚浓度呈正比，随着提取物中多酚含量的增加，其吸光度也增大，还原力也越强[19-20]。根据清除率拟合曲线，70%甲醇：y=7.935x+0.056 3，R2=0.951 5；70%乙 醇 ：y=10.315x +0.207 9，R2=0.991 7；70%丙酮：y=7.985x+0.056 3，R2=0.968 0；蒸馏水：y=7.280x+0.192 4，R2=0.955 5；VC：y=7.195x+0.269 7，R2=0.965 4，其中 VC 作为对照。由表2 知，经线性拟合，黑牛肝菌供试溶剂多酚提取物EC50值，70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮、蒸馏水、VC 分别为：（0.056 2±0.002）mg/mL、（0.033 7±0.003）mg/mL、（0.033 9±0.005）mg/mL、（0.047 2±0.006）mg/mL、（0.040 2±0.006）mg/mL。供试溶剂提取物的还原能力排序为70%乙醇>70%丙酮>VC>蒸馏水>70%甲醇，这说明黑牛肝菌有较强的抗氧化性[20]。由图3可知，供试溶剂提取物多酚含量相同其抗氧化活性越不同，说明抗氧化活性还受提取溶剂的影响。黑牛肝菌多酚抗氧化物质主要分布在中等极性溶剂中，在极性溶剂中分布较少。

综合三种抗氧化活性数据可以看出，70%丙酮的黑牛肝菌多酚提取物对自由基的清除能力都较强，黑牛肝菌多酚提取物具有好的体外抗氧化活性，是一种潜在的天然食品抗氧化剂。

图3 还原Fe³+能力

3 小结

采用不同溶剂提取黑牛肝菌中的多酚，进行三种抗氧化活性测定，分析其抗氧化活性的差异。结果表明，以70%丙酮、70%甲醇、70%乙醇、蒸馏水作为提取溶剂时，所得多酚含量分别为（10.4±0.055）mg/g、（9.6±0.034）mg/g、（8.8±0.022）mg/g、（8.0±0.036）mg/g；多酚含量与抗氧化活性相关性较高;多酚浓度越高其抗氧化性越强，不同溶剂提取物对DPPH 自由基、ABTS 阳离子自由基都具有很好的清除能力，且清除能力与多酚浓度呈良好的线性关系，对铁离子具有很好的还原能力。抗氧化物质主要分布在中等极性溶剂中，在极性溶剂中分布较少。