Ang-2表观遗传学修饰在压力介导的椎间盘退变中的作用机制研究*

周鹃#王志伟#冯晶*夏平赵晓龙汪朋李艳丽陈永杰

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）引起的下腰痛在现代社会中非常普遍，造成了严重的社会负担和患者生活质量的下降。研究表明，髓核是椎间盘行使功能的中心和最早发生退变的部位，髓核细胞退变及其导致的细胞外基质成分改变是椎间盘退变早期最重要的病理特征[1]。遗传、年龄、体重、过度压力、炎症刺激等是椎间盘退变的主要病因[2]。在过度压力条件下，髓核细胞外基质合成代谢减少，分解代谢增加，从而导致椎间盘退变[3]。近年来，研究表明压力因素通过表观遗传学修饰的途径影响着IDD的发生，但其如何调控椎间盘退变的机制却鲜有报道[4]。表观遗传学修饰是指细胞DNA序列未发生改变，但基因的功能发生可逆、可遗传的改变[5-6]。本研究探讨表观遗传修饰改变对过度压力介导的IDD进程的影响，为IDD的临床治疗和疾病预防提供思路和理论实验基础。

1 材料与方法

1.1 获取正常与退变椎间盘标本

对武汉市中西医结合医院2018年1月至2019年6月采用脊柱外科手术的患者术前进行椎间盘退变进行Pfirrmann分级，并在手术中收集了4例脊柱侧弯患者正常的髓核组织及4例腰椎间盘突出症患者退变的髓核组织。所有标本均在离体30 min内提取髓核细胞。该研究已获本院临床伦理委员会批准（批准号:[2017]9），所有患者知情同意并签署临床研究知情同意书。

1.2 主要药品与试剂

实验中使用的5-氮杂胞苷（Selleck公司，上海），Angiopoietin 2抗体、兔多克隆抗体Tie-2以及Aggrecan抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，武汉），兔多克隆抗体CollagenⅡ抗体和SOX-9抗体（Abcam公司，英国），兔多克隆抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司，杭州），正常山羊血清和荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，武汉），细胞培养基（Gibco公司，美国）。

1.3 髓核细胞的分离及培养

获取的髓核组织清洗，将髓核组织剪成小碎块，用0.1%Ⅱ型胶原酶消化6～8 h，离心后收集沉淀、过滤，收集悬液后再次1 000 rpm×5 min离心。以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养，置于含5%CO2的培养箱中，7 d后首次更换培养液，以后每周更换培养液2次。在倒置相差显微镜下观察原代髓核细胞形态，当细胞融合90%时传代培养。取P=1代进行后续试验[7]。

1.4 髓核细胞的分组处理

此实验分为两部分，第一部分分为4组:取生长情况良好的正常髓核细胞分为两组，将两组细胞放入适宜温度和CO2浓度的培养箱中培养24 h，后将第1组细胞放入压力设置为0 MPa的培养箱中（正常空白组），第2组细胞放入压力为1 MPa、其余条件相同的培养箱中（正常压力组）;同样的方法选取退变的髓核细胞分为两组:第3组为0 MPa压力环境（退变空白组），第4组为1 MPa压力环境（退变压力组），两组其余培养条件都相同。24 h后对4组髓核细胞分别进行RT-PCR、Western Blot和细胞活力等检测。第二部分分为3组:取生长情况良好的正常髓核细胞分为3组，将3组放入适宜温度和CO2浓度的培养箱中培养24 h。后将第1组细胞放入压力为0 MPa的培养箱中（空白组）;第2组细胞放入压力为1 MPa、其余条件相同的培养箱中（压力组）;第3组细胞放入压力为1 MPa、其余条件相同的培养箱中，加入10 mol/L浓度5-氮杂胞苷处理（5-氮杂胞苷组）。24 h后，再次进行上述相关检测。具体流程见图1。

图1 Ang-2表观遗传学修饰在压力介导的椎间盘退变中的作用机制

1.5 RT-PCR

用Trizol试剂（Ambion）分解髓核细胞后分离提取总RNA，计算RNA浓度，随后用DL2000 DNA Marker（TIANGEN）将提取的RNA逆转录成cDNA，最后用实时荧光定量PCR检测4组细胞中Ang-2、Tie-2、Aggrecan、CollagenⅡ和SOX-9表达量。绘制上述各靶基因转录RNA的溶解曲线图，以2-△△Ct进行数据处理，各引物序列表见表1。

表1 引物序列表

1.6 Western Blot检测

获取各组髓核细胞的总蛋白后测定其浓度，然后将提取的蛋白放入100℃沸水浴中变性。制备好电泳胶，取40 g蛋白，进行电泳分离。1 h后将蛋白转膜、浸泡，在25℃室温条件下摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗:GAPDH（1∶1 000）;SOX-9（1∶1 000）;Aggrecan（1∶600）;Ang-2（1∶1000）;CollagenII（1∶1000）;Tie-2（1∶500），浸泡12h。洗膜后加入辣根过氧化物酶标识的山羊抗兔的二抗，孵育2 h后暗室曝光，最后采用BandScan法分析胶片灰度值。

1.7 免疫荧光实验

将各组髓核细胞爬片良好的玻片用PBS浸泡清洗，收集髓核细胞。用4%的多聚甲醛固定爬片。0.5%Triton X-100（PBS配制）（碧云天，上海）室温通透。加入正常血清后封闭，吸掉封闭液后滴加一抗Collagen II（1∶50稀释）、Aggrecan（1∶50稀释），放入湿盒，4℃孵育过夜。爬片使用PBS溶液浸洗后加入荧光二抗荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG（1∶100稀释比例），在37℃温度条件下的湿盒中孵育1 h。加入40，6-二氨基-2-苯基吲哚DAPI（碧云天，中国上海)避光孵育，对髓核细胞进行染核，染核后封片，最后通过荧光显微镜来收集细胞图像。

1.8 MTT法检测

取生长状态良好的细胞，培养置DMEM/F12培养基（Gibco公司，美国）中，当达到1×105/mL密度后以100 L/孔的密度将混液加入96孔培养板中，在含有细胞孔附近的孔中滴入等量的PBS溶液，放入36℃过夜，当达到培养所需时间后，每孔滴入10 L MTT（BIOSHARP，武汉），37℃温度条件下培养3～4 h。采用酶标仪568 nm检测各个培养孔的吸光值。

1.9 统计学方法

所有数据都采用均数±标准差的形式表示。本研究使用Graphpad Prism8.0软件进行统计学分析，每组实验重复3次。本研究采用单因素方差分析和两两比较分析方法<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 压力刺激对髓核细胞Ang-2/Tie-2信号通路及细胞外基质的影响

笔者分别将正常和退变两种髓核细胞中的各1组放置于1 MPa压力的环境中，培育24 h后，分别检测4组髓核细胞中Ang-2的表达情况。结果表明，压力刺激使髓核细胞中Ang-2的表达增加，差异具有统计学意义（<0.05）（见图2A、图2F）。另外用RT-PCR和WesternBlot检测4组细胞中Tie-2、CollagenⅡ、SOX-9和Aggrecan的转录和翻译。结果表明，压力刺激的髓核细胞中Tie-2的转录和翻译明显增加（见图2B、图2G），CollagenⅡ、SOX-9和Aggrecan的转录和翻译明显减少，差异有统计学意义（见图2C-E、图2H-J）。随后对上述4组细胞中的CollagenⅡ和Aggrecan进行免疫荧光检测，结果表明压力刺激抑制两者的表达（见图2K、图2L）。

2.2 DNA甲基化抑制剂对Ang-2/Tie-2信号通路的影响

将空白组、压力组及5-氮杂胞苷组3组髓核细胞的RNA和蛋白质进行RT-PCR和Western Blot检测。结果表明，DNA甲基化抑制剂减少了压力诱导的髓核细胞中Ang-2和Tie-2的转录和翻译，差异具有统计学意义（<0.05，见图3）。

2.3 DNA甲基化抑制剂对髓核细胞活力及细胞外基质的影响

用MTT法检测上述3组髓核细胞的活力及免疫荧光法测定CollagenⅡ、Aggrecan的表达情况。结果表明，压力的刺激使髓核细胞活力下降，细胞外基质（CollagenⅡ、Aggrecan）表达量减少;而DNA甲基化抑制剂可提高髓核细胞的活力及抑制压力诱导的细胞外基质表达减少，差异具有统计学意义（<0.05，见图4）。

图2 A-E.4组细胞Ang-2、Tie-2、CollagenⅡ、SOX-9、Aggrecan mRNA相对表达量;F-J.4组细胞Ang-2、Tie-2、CollagenⅡ、SOX-9、Aggrecan蛋白的Western Blot蛋白条带图及蛋白印迹灰度值与内参蛋白GAPDH的比值;K.4组细胞CollagenⅡ表达荧光图及相对荧光强度柱状图;L.4组细胞Aggrecan表达荧光图及相对荧光强度柱状图

图3 A.3组细胞Ang-2 mRNA相对表达量;B.3组细胞Tie-2 mRNA相对表达量;C.3组细胞Ang-2蛋白的Western Blot蛋白条带图及蛋白印迹灰度值与内参蛋白GAPDH的比值;D.3组细胞Tie-2蛋白的Western Blot蛋白条带图及蛋白印迹灰度值与内参蛋白GAPDH的比值

图4 A.3组细胞CollagenⅡ表达荧光图及相对荧光强度柱状图;B.3组细胞Aggrecan表达荧光图及相对荧光强度柱状图;C.3组细胞OD值

3 讨论

椎间盘退变（IDD）是一种以髓核细胞发生退变表型和细胞外基质降解为特征的退行性疾病。IDD的病因主要包括过度压力、心血管疾病、感染等一系列环境和基因因素[8]。研究发现，适度压力对椎间盘具有保护作用，但是过度压力则会使髓核细胞数量和细胞外基质基因表达减少，进而加剧椎间盘细胞死亡[9]。本研究结果表明，压力刺激调控髓核细胞外基质相关靶基因（CollagenⅡ、SOX-9和Aggrecan）的表达，抑制髓核细胞活性。因此，过度压力在IDD发展过程中扮演重要角色，延缓过度压力对髓核细胞的影响在IDD的防治中具有重要意义。

Ang-2是一种作用于血管内皮细胞的分泌型细胞调节因子，能识别并抑制其特异性酪氨酸激酶受体（Tie-2）激活，在血管发育、重构过程起重要作用[10-11]。前期研究表明，退变髓核细胞中Ang-2表达和释放增加，通过介导髓核细胞凋亡和细胞外基质降解推动IDD进程[12-13]。然而，调控Ang-2表达的因素，以及减少Ang-2的表达对过度压力导致的IDD的影响需进一步研究。

表观遗传学调控是指不改变基因的核苷酸序列的前提下使基因功能发生改变，对个体的生长发育疾病等过程产生影响[5-6]。DNA甲基化抑制剂通过影响环境因素，从而在不损害基因组完整性的前提下，对基因组信息作出适当修饰，以适应环境变化[14]。已有学者研究表明，基因启动子区甲基化状态改变可以显著影响Ang-2基因表达程度，在一系列恶性肿瘤和退行性疾病的发生发展中起着十分重要的作用，甚至能成为疾病程度和预后的判断指标[15]。然而，Ang-2表观遗传修饰状态的改变在IDD进程中的作用仍未见报道。本研究结果首次表明压力刺激明显增加了Ang-2和Tie-2的表达，然而DNA甲基化抑制剂通过抑制Ang-2、Tie-2的表达延缓压力诱导的CollagenⅡ、Aggrecan减少及髓核细胞活性下降。因此，以过度压力为特征的髓核细胞外环境发生改变，导致了Ang-2基因表观遗传修饰状态改变，进而发生过度表达，Ang-2/Tie-2信号通路过度激活使髓核细胞的活力降低以及细胞外基质的降解，最终导致IDD。本实验在前人研究基础上首次探讨调控Ang-2表观遗传修饰对IDD进程的影响，可为IDD的临床治疗和疾病预防提供新的思路及理论实验基础。

本实验研究只是初步探讨了DNA甲基化抑制剂对Ang-2/Tie-2信号通路的影响，未进行靶向干预研究。后续实验可靶向调控Ang-2/Tie-2信号通路，进一步研究表观遗传修饰对压力诱导椎间盘退变的影响。