分子标记技术在茄子种质资源评价中的应用研究进展

廖秋石，雷 刚，陈学军，袁欣捷，黄月琴，周坤华，方 荣*

( 1.江西省农业科学院 蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200; 2.江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045)

茄子(SolanummelongenaL.)为茄科茄属蔬菜作物，是我国的主要蔬菜作物之一，年种植面积约80.6万hm2[1]。农作物种质资源是种质创新、性状优化和新品种选育的物质基础[2]。茄子种质资源是蔬菜种质资源的重要组成部分，我国是茄子的次生起源地[3]，栽培历史悠久，茄子种质资源十分丰富，国家种质中期库已收集茄子种质资源1468份[4]。长期以来，人们常采用形态标记方法分析、评价作物种质资源，但形态标记易受环境的影响，同一性状在不同环境条件下，表型往往存在一定差异；而DNA分子标记具有数量多、表现稳定，不受环境条件影响等特点，能对种质资源进行更为精准的评价与鉴定，现已广泛应用于农作物种质资源的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、QTL定位等诸多方面。本文综述了分子标记技术在茄子种质资源评价中的应用研究进展，以期为茄子种质资源的高效利用与种质创新提供理论参考。

1 分子标记的主要类型及特点

广义的分子标记是指可遗传的且可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的DNA特异性片段。早在1980年遗传学家Botstein等[5]第一次提出了DNA片段多态性作为遗传标记的想法，此后，研究者开始将分子实验方法应用于作物遗传多样性的研究。DNA作为染色体组分存在于细胞核内，其一级结构，即碱基的排列顺序储藏决定了遗传信息的种类和数量，因此，分析DNA的碱基序列是研究遗传多样性最直接的方法。1985年，关于PCR技术的文章首次发表，迄今已经发展了多种基于DNA多态性的分子标记技术[6]。根据对DNA多态性的检测方法，分子标记可以分为4类[7-9]，一是基于Southern杂交检测的RFLP标记；二是基于PCR的分子标记，如RAPD、SSR和ISSR、SRAP等；三是基于PCR与限制性酶切技术结合的分子标记，如AFLP、CAPS等；四是InDel、SNP等新型分子标记[10，11]。

1.1 RFLP

RFLP(Restriction fragment length polymorphisms)即限制性片段长度多态性，是最早应用于作物品种鉴别和品系纯度检测的第一代分子标记技术[12]。该技术涉及基因组DNA的提取、DNA 片段的克隆、电泳、限制性内切酶酶切、southern印迹转移、DNA 探针制备以及分子杂交等一系列步骤[13]。RFLP为共显性分子标记，能区分纯合体和杂合体，且非等位基因间无互作[14]；其次，该标记源于DNA水平上的自然变异，数目可以是无限的[15]，并且结果稳定，重复性较好[16]。但RFLP分子标记操作步骤较多，周期长，当检测少数探针时成本略高[17]，且在检测中需使用放射性同位素，安全标准较高。

1.2 RAPD

RAPD(Random amplified polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA标记，该标记技术是由美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh在1990年同时发明的，是建立在基于PCR基础上的一种随机扩增多态性的DNA分子标记技术[18]。此技术是以不同个体基因组DNA为模板，把一条人工合成的随机十碱基寡脱氧核苷酸单链作为引物，在特定条件下进行扩增[19]。扩增所得产物经电泳分离后显色，分析所得产物基因片段的多态性，根据多态性进而推测生物体内DNA多态性与表型性状的表现规律[20]。该技术对DNA样品数量及质量要求不高，无需事先了解DNA序列；引物通用性高，自动化程度高，试验成本低，技术简单，检测速度较快，已广泛应用于作物种质遗传多样性等方面的研究[19，21]。缺点是存在显性遗传问题，不能识别杂合位点，而且稳定性不佳，导致重复性差[22]。

1.3 SSR

SSR(Simple sequence repeat)即简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸为基本单位，经过重复串联多次构成的一段DNA重复序列[23]。由于其两端序列保守性较强，因此，可以设计特异性引物进行PCR扩增，通过电泳检测分析基因位点的多态性[24]。SSR分子标记具有不受环境限制，遗传多态性丰富，共显性、稳定性好，基因组覆盖面广等优点[2, 25]，是一种被广泛使用的分子标记技术。传统开发的SSR标记主要借助于结构基因组学和比较基因组学的相关技术手段，操作复杂、耗时长、资金投入较大等。但随着科学技术的进步，以转录组测序为基础的新一代高通量测序技术为低廉、高效、大规模发展SSR标记提供了新的有效方法[26]。

1.4 ISSR

ISSR(Inter-simple sequence repeat)即简单重复序列区间，它是在SSR标记的基础上发展起来的、基于PCR的分子标记技术[27, 28]。该分子标记的主要特点是无需知道靶标序列背景的情况下，能够直接扩增出2个方向相反、序列相同的基因片段[29]。与上述分子标记技术相比，ISSR技术多态性丰富，稳定性强，重复性好，操作简单，成本相对较低，产物特异性强[30-32]，已被广泛应用于植物遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究[33-35]。

1.5 SRAP

SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)即相关序列扩增多态性，是美国学者提出的基于PCR技术的新型分子标记技术[36]。该技术通过一对引物对开放阅读框(open reading frames，ORFs)进行PCR扩增。而特异性引物利用GC含量丰富的外显子和AT含量丰富的启动子和内含子这一特点进行设计，由于不同个体中启动子、内含子与间隔序列不同，利用基于外显子和内含子、启动子设计的上下游引物配合，就会在不同的个体间产生多态性[37, 38]。SRAP分子标记具有以下优点：首先该标记的正、反向引物可自由组合，大大降低合成引物的费用，且提高引物的利用率[39]；其次该标记是基于PCR扩增的标记技术，较其他类型分子标记而言对DNA纯度和浓度要求不高，因此可以降低对仪器设备的要求，同时减少操作步骤与实验复杂性[40]；再其次，该标记由于引物设计的特殊性，多数在基因组中均匀分布，因此比RAPD等标记稳定且多态性高[41]；此外，SRAP标记适用范围广泛、多数显性，检测位点较多，故可提供较高的样品信息量，稳定、可靠性高[42]。尽管SRAP标记具有众多优点，但由于此技术未利用扩增区域序列的信息，产生的标记在染色体上随机分布，在筛选与目标性状连锁的分子标记时，必须与混合分组分析法等一起使用[43]。

1.6 AFLP

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)即扩增片段长度多态性，是基于PCR的一种选择性扩增限制性DNA片段技术，同时也是一种高效能的基因检测技术，可在一次单个反应中检测到大量的基因片段[44]。该技术同时具有RFLP和RAPD技术的优点，检测高效，且不受环境条件的影响，重复性好、多态性丰富、稳定性高[45]，已广泛应用于植物亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、分子标记筛选和高密度遗传图谱构建等研究[46， 47]。缺点是对供试DNA质量要求比较高，步骤繁琐，操作技术难度大，为显性标记，易产生假阳性，且结果不可重复[48]。

1.7 CAPS

CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)即酶切扩增多态性序列，它实质上是PCR与RFLP技术结合的一种方法。其原理是利用已知位点的DNA序列设计出特异性PCR引物，再利用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用限制性内切酶消化PCR产物，通过琼脂糖电泳分离酶切片段以检测多态性[49，50]。CAPS是一种共显性分子标记，优点是避免了RFLP分析中膜转印步骤，又能保持RFLP分析的精确度[51]，操作简便、结果稳定可靠[52]，所需DNA量比较少，浓度要求不严格[53]，较多限制性内切酶可与扩增DNA酶切，检测到多态性的机会比较大[42]。虽然CAPS标记有许多优点，但是因为它必须使用限制性内切酶，因此，筛选合适的酶组合工作量也较大；此外，已发现的突变酶切位点少，限制了该标记的大规模开发应用。

1.8 InDel

InDel(Insertion-deletion)分子标记是基于全基因组测序而开发的第三代标记技术，是在等位基因位点上由于一定数量的核苷酸插入或缺失，根据基因组中插入缺失的位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，从而产生长度多态性变异[54]。该分子标记具有带型简单、准确性高、变异稳定、多态性丰富、容易检测等特点[55]。InDel标记属于一种单位点分子标记，可以克服多位点标记进行遗传多样性分析和辅助选择育种中出现的问题[56]，但其携带的遗传信息量有限，遗传分析效率有待进一步提高[10]。

1.9 SNP

SNP(Single nucleotide polymorphism)即单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性[57]。它只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，但通常所说的SNP并不包括后两种情况[58]。该分子标记位点多、分布广、易实现分析的自动化，具有稳定性好、突变频率低、代表性强等特点[59]，在马铃薯[60]、番茄[61]、辣椒[62]等蔬菜作物中均有应用。

2 分子标记技术在茄子研究中的应用

2.1 遗传连锁图谱的构建

遗传连锁图谱，是指以染色体重组交换为基础，以染色体重组交换率为相对长度单位，采用遗传学方法把基因或者其他专一的多态性标记构建在染色体上，形成连锁的图谱[63]。遗传连锁图谱的构建是遗传学基础研究的一个重要组成部分，对基因的定位和克隆具有重要的意义，并可为育种工作提供指导[64]。

谢立峰等[65]以茄子材料09-101-M为母本、10TL102-F4-1为父本构建的重组自交系为作图群体，采用SSR、AFLP分子标记，共筛选出多态性较好且条带清晰稳定的22对SSR引物和129对AFLP引物，多态性比例为24.6%；应用这些多态性引物进一步进行群体扩增，共获得173个多态性位点；构建了总长度为991.7 cM、共包含157个位点、平均图距为6.32 cM的遗传连锁图谱。房超等[66]利用母本巴-3(从巴基斯坦引进)与父本255-4-4(海南野生茄)杂交产生的118个F2代单株为作图群体，使用SRAP分子标记技术构建了总长为381.3 cM、标记平均间距为19.1 cM的分子连锁图谱。曹必好等[67]利用RAPD技术在茄子两个纯合自交系E-31和E-32杂交后产生的119株F2代群体中，进行了多态性位点连锁分析，发现77个标记定位于12个连锁群上，覆盖总基因长度651.19cM，标记平均间距8.45 cM。牛玉[68]以自交系05-3-6-14-3为母本、湖南地方品种“湖南小圆茄”为父本构建F2代群体，用F2代群体的88个单株，采用AFLP、SSR、CAPS 3种分子标记技术构建了总长633.3 cM、标记平均间距为3.86 cM的遗传图谱。一般而言，用于QTL定位的遗传图谱标记平均间距要小于10 cM，当图谱总长越长、标记间距越小时，寻找到有效目的基因的概率就越高[69]；可见茄子遗传图谱的构建仍有很大的发展空间，图谱的长度和标记密度还有待进一步提高[70]。

2.2 QTL定位

张环宇等[71]基于F2代群体和SSR标记、AFLP 标记，构建了包含14个连锁群的遗传图谱，图谱覆盖基因组长度为1040.3 cM。利用该图谱鉴定果长QTL 1个、果径QTL 2个、果形指数QTL 1个、花青素积累相关QTL 1个，可解释3.8%～12.8%的表型变异。葛海燕等[72]利用父本绿茄“131”和母本上海本地长茄“141”为作图亲本，获得了具有237个株系的F2代群体，利用SSR标记构建连锁图谱，共定位了单果质量、果长、果径、果形指数、果萼大小等果实相关性状的QTLs 9个，可解释4.0%～11.9%的表型变异。耿树文[73]以圆顶茄子材料283为母本，以尖顶茄子材料284为父本构建F2代群体，进而利用SLAF-seq高通量测序技术获得亲本和F2代单株的SLAF标签，对SLAF标签进行筛选后构建了1张包含12个连锁群的高密度遗传连锁图谱，该图谱覆盖茄子基因组长度达2126.6 cM，平均图距为0.69 cM。在第5和第10连锁群上获得3个果顶形状QTLs，根据连锁群的不同命名为fe5.1、fe10.1和fe10.2，表型贡献率分别为26.7%、10.0%、11.4%。乔军[74]以茄子栽培种自交系106为母本，以栽培种自交系113为父本杂交构建F2群体，用40对SSR标记和99对AFLP标记，对F2群体154个单株进行分析，获得了总长1007.9 cM、标记间平均图距为9.3 cM的遗传图谱，获得2个果形指数QTLs、5个果长QTLs、2个果径QTLs，表型贡献率最高的达到45.0%。

2.3 遗传多样性与亲缘关系分析

Evans Mutegi等[75]使用14个SSR标记检测印度茄子自然种群和南部3个栽培种群的遗传多样性和种群结构，结果显示种群间出现了强烈分化并且具有显著的远缘隔离现象。Ali等[76]使用RAPD和ISSR标记分析了143个中国栽培茄子、106个地方品种和37个杂交品种的遗传多样性， RAPD引物在地方品种、杂交品种和所有143个品种中产生的多态率分别为13.9%、14.8%和14.7%；而ISSR引物在地方品种、杂种和所有143个品种中产生的多态率分别为13.5%、20.7%和15.3%。ISSR比RAPD标记能更有效地检测遗传多样性。韩洪强等[77]利用收集到的包括野生近缘种在内的126份茄子材料进行SSR分子标记和形态学标记鉴定，以评价其种质资源的遗传多样性和亲缘关系，结果表明，半栽培种与野生近缘种材料进化关系较近，而与栽培种距离相对较远，这说明栽培种在驯化之后的遗传变异比较大，与其祖先的亲缘关系越来越远。曾华兰等[78]用筛选出的17对SRAP引物在32份对黄萎病具有一定抗性的茄子材料上进行了遗传多样性与亲缘关系分析，共检测出276个条带，其中多态性条带212个，多态性比例为76.81%，32份茄子品种的遗传距离介于0.0231～0.8391，平均遗传距离为0.4535，遗传多样性较为丰富，有利于茄子杂交育种亲本的选择与利用。

肖熙鸥等[79]利用22对SRAP的引物对36份茄子栽培种进行了遗传多样性分析，结果表明36 份茄子品种间遗传相似系数在0.568～0.870，平均遗传相似系数为0.757，说明供试材料遗传背景相对狭窄，这些材料虽来自不同地区，但不断交流导致基因渗透，因此，应不断引进、创新种质资源，拓展茄子的遗传背景，丰富遗传多样性。房超等[80]用SRAP分子标记技术对87份茄子及其近缘野生种进行了遗传多样性分析，结果显示，群体平均杂合度为0.6962，平均多态信息含量为0.6441，平均相似系数为0.822，说明参试茄子种质的遗传相似性较大，遗传多样性不丰富。于晓虎[34]利用ISSR和SSR分子标记技术对76份茄子种质进行了遗传多样性分析，供试茄子品种间的相似系数介于0.454～1.000之间，平均为0.639，说明供试茄子的遗传多样性较低。廖毅等[45]利用AFLP分子标记技术对来自国内外的54份茄子栽培种以及4份近缘野生种进行了遗传多样性分析，栽培种内平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均Nei’s基因多样度和平均香农指数分别为1.176、1.084、0.051和0.079，都相对较低，表明茄子种内遗传基础相对狭窄。

2.4 品种鉴定与纯度分析

杨旭等[81]以16份茄子杂交组合及其亲本为供试材料，通过共显性SSR分子标记，在杂交后代扩增产物中，比较亲本与杂种PCR的扩增条带，当杂种F1代具有父母本互补型或父本型条带，则为真杂交种，反之仅有母本型条带则为假杂交种，结果显示有3份F1代为假杂种，其余13份为真杂种，与田间鉴定结果一致。李倩等[82]利用115对SSR引物对早红茄1号和早红茄2号双亲进行多态性筛选，从中筛选出引物K08和M11，分别对早红茄1号和2号种子的纯度进行鉴定，结果表明2个品种的纯度分别为95.3%和96.9%，与田间检测结果无显著差异(分别为95.8%和97.2%)。王利英等[83]利用236对SSR引物对3个茄子品种进行多态性筛选，筛选出用于茄子纯度鉴定的多态性引物15对，利用该系列引物进行纯度鉴定，1-2010、3-2010和9-2010 3个品种的纯度分别为98%、96%和100%，与田间检测结果一致。陈继兵等[84]通过多次重复试验，利用SRAP分子标记技术，从100对引物组合中筛选出了2对引物，可用于闽茄5号及其近缘新组合间的检测，结果表明有1对引物(Em2/Me5)扩增出闽茄5号及其父本的多态性条带；1对引物(Em3/Me3)扩增出新组合(06-29×06-16)及其父本的多态性条带，通过检测F1代中是否出现双亲的特异性条带，可以对不同品种进行鉴定。吉康娜等[54]从19个多态性标记中抽取3对多态性较好的InDel引物(EP-215、EP-1203和 EP-1067)，利用InDel标记对茄子品种“NFENG-3”进行纯度鉴定，3对InDel引物在166株植株中均扩增出条带，其中2对(EP-215、EP-1203)具有多态性，并且两对引物扩增出的条带中有149株的扩增条带表现一致，17株有不一致的条带，品种纯度为89.8%，与田间检测结果吻合，说明InDel标记能够用于茄子杂种一代纯度的快速鉴定。上述研究结果表明，采用分子标记检测品种纯度，可以区分出形态学标记难以鉴别的细微差异，快速、准确、省时省力[85，86]。

2.5 分子标记辅助选择育种

Mutlu等[87]使用SRAP、RGA、SRAP-RGA和RAPD标记检测茄子枯萎病抗性基因，用2316个引物组合筛选F2代和BC1代群体，用于抗枯萎病茄子DNA检测，发现SRAP标记Me8/Em5、SRAP-RGA标记Em12/GLPL2与抗性基因紧密连锁，遗传距离为1.2 cM；RAPD标记H12与抗性基因的遗传距离为2.6 cM，并将SRAP标记转化为实用的SCAR标记。廖毅等[88]采用AFLP技术对58份不同果皮颜色茄子种质(包括栽培种和野生近缘种)进行亲缘关系分析，筛选出与果皮颜色相关的AFLP标记，并转化为SCAR标记，可以应用于茄子果色的分子标记辅助育种。Chen Mengqiang等[89]使用紫色花“Blacknite”和白花“小圆”杂交的F2代群体，将花青素合成酶精确定位于InDel标记Indel8-11和CAPS标记Efc8-32之间约165.6 kb范围的8号染色体上，在生物信息学分析的基础上，把29个基因定位于花青素合成酶靶区，其中有两个为花青素合成酶候选基因，1个花青素合成酶基因(Sme2.5_01638.1_g00003.1)在启动子和编码序列中是保守的，亲本间没有任何核苷酸变化；另一个基因(Sme2.5_01638.1_g00005.1)被检测有4个单核苷酸多态性，而且在38位点的单碱基对缺失使花青素合成酶过早终止，导致花青素积累能力丧失，与白花及其他组织相比，花青素合成酶在紫色花中表达强烈，Sme2.5_01638.1_g00005.1是控制茄子花中花青素合成酶的良好候选基因。

3 展望

近年来，随着分子生物学的不断发展，人们应用分子标记技术对茄子种质资源进行了大量的研究，这些研究克服了传统遗传标记研究的不足，进一步阐明了茄子种间及种内的亲缘关系及遗传多样性变化特点，构建了一批遗传图谱，定位了一些重要农艺性状QTLs，为茄子种质资源的深化利用奠定了坚实的基础。但与茄科蔬菜中的番茄、辣椒作物相比，茄子种质资源分子生物学研究还存在较大的差距：一是遗传图谱间距较大，不饱和，QTL定位精度差；二是很多重要性状QTLs或优异基因尚没有得到发掘，如抗性相关基因、品质相关基因等；三是分子标记辅助选择育种还处于试验阶段，相关的基础研究还十分薄弱。这些都有待今后进一步深人探讨。随着茄子高质量基因组序列组装的完成[90]，分子标记技术将在茄子种质资源发掘、创新和遗传改良方面发挥更大的作用，相关研究也必将取得更大进展。