小麦TaNAC-B072基因的克隆和表达分析

陈文烨,杨 帆,刘永伟,董福双,赵 和,柴建芳,吕孟雨,周 硕

(河北省农林科学院 遗传生理研究所/河北省植物转基因中心,河北 石家庄 050051)

非生物胁迫是影响植物生长发育和作物产量的重要因素[1]。植物在生长发育过程中,经常遭受高温、干旱、冷害、高盐、重金属、机械损伤等各种逆境胁迫,这些逆境胁迫会影响植物的生长发育,甚至导致其死亡[2-3]。在长期的进化过程中,植物逐渐形成了对逆境的适应和抵抗机制[4],在分子、细胞、器官、生理生化等水平上作出及时调节[5]。在受到非生物胁迫后,植物通过系列信号分子调节相关抗逆基因和蛋白的表达,来改变自身生理生化水平以适应逆境。

转录因子可与真核生物启动子区的顺式作用元件特异性结合,是调控基因表达水平的DNA结合蛋白,在植物对非生物胁迫应答过程中起重要作用[6-11]。NAC(NAM, ATAF1/2和CUC2)[5]是一类植物特有的,并广泛存在于植物中的转录因子家族[12-13]。大多数NAC转录因子具有N端保守结构域和C端可变结构域[8],其N端保守的NAC结构域结合DNA序列,与其它NAC蛋白形成二聚体，而羧基端结构域是高度可变的,可激活或抑制基因转录[7-8]。研究发现, NAC转录因子可以发挥多种生物学功能,调控植物的生长发育[14-15]、器官的形成[16]、衰老[6,17-18]和生物量[15,19]等,同时可以参与植物对生物[9]和非生物胁迫[6,13,15,20-22]的响应。

迄今为止,利用生物信息学方法已成功预测了大量NAC转录因子基因[23],尤其是在模式植物拟南芥和水稻中的研究比较多,已经在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中发现的NAC转录因子基因有117个，在水稻(Oryzasativa)中有151 个，在二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中有101个，在三角叶杨(Populustrichocarpa)中有163个，在大豆(Glycinemax)和烟草(Nicotianatabacum)中各有152个[7,24-26]。水稻OsNAC10基因过量表达,可增强对干旱、盐胁迫的耐受性,在干旱胁迫下水稻产量可以增加25%～42%[27]。拟南芥的ATAF1基因功能丧失后,抗旱能力提高[28]；但也有研究发现,拟南芥中ATAF1基因的过量表达可增强抗旱性[29]。迄今对小麦NAC基因的相关报道较少,已有研究表明小麦TaNAC29基因在抗衰老、对盐和干旱胁迫的响应中发挥重要作用；ABA信号通路和抗氧化酶参与TaNAC29介导的胁迫耐受机制[30]。本试验从小麦cDNA 中克隆了1个NAC转录因子基因TaNAC-B072,并对TaNAC-B072基因进行了生物信息学分析、组织特异性表达检测及不同非生物逆境胁迫下的表达特征分析,为深入研究该基因的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以河北省农林科学院遗传生理研究所育成的国审小麦品种金禾9123和小麦品种中国春为研究材料。小麦种子由河北省农林科学院遗传生理研究所植物转基因中心保存。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的处理及取样 选取籽粒大小均匀、饱满的金禾9123种子,在铺有湿润滤纸的培养皿中培养,发芽后选取生长近似的植株置于光照培养箱(光周期为16 h/8 h;温度为24～26 ℃) 中水培,14 d后进行高盐(NaCl)、渗透(PEG)和冷(4 ℃)胁迫处理。具体处理方法为:对照组(NC)的幼苗置于光照培养箱中水培,在培养0、1、3、6、12、24、48 h后取样;高盐(NaCl)胁迫组使用200 mmol/L NaCl处理幼苗；渗透(PEG)胁迫组使用16.1%的PEG处理幼苗；将冷(4 ℃)胁迫组的幼苗置于4 ℃的光照培养箱中培养。后3种处理分别于处理后1、3、6、12、24、48 h取样。处理的样品(每个时间点为8株混合样)分别取根和地上部分。

不同组织的样品取中国春灌浆期植株的根、茎、叶、旗叶和种子,每个样品为10个植株的混合样。

1.2.2 RNA的提取及反转录 用Trizol法提取植物的总RNA； cDNA第一链的合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)试剂盒。

1.2.3 小麦TaNAC-B072基因的克隆和生物信息学分析 以拟南芥AtNAC072基因的mRNA (NM_001084983.1)为参考序列,在小麦中进行比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),在3B染色体上找到了1个可能的NAC基因,其在URGI的小麦Wheat reference sequence chromosome 3B CDS数据库中的编号为TRAES3BF073600100CFD_t1。根据序列设计引物(TaNAC-B072-F: ATGGCCACGTCATGCCCAG； TaNAC-B072-R: TCATGACCTCCTAAGGCTGGT),以中国春的cDNA为模板。PCR反应使用TransStart FastPfu FlyDNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司),其50 μL反应体系为: FastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL、dNTP Mix 4 μL、5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL、PCR Stimulant 10 μL、上下游引物各1 μL、小麦cDNA 1 μL、ddH2O 22 μL。PCR扩增程序为:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 5 min。将回收的目的片段与Blunt vector(北京全式金生物技术有限公司)连接,转化到E.coliDH5α,通过PCR对菌落筛选阳性克隆,并进行测序验证。用 ExPaSy 提供的在线Protparam软件(http://web.expasy.org/protparam/)进行氨基酸数目、分子量、理论等电点和保守序列分析。利用Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在线软件对蛋白序列进行比对;利用MEGA 6.0软件中的Neighbor-Joining方法构建系统进化树(Bootstrap:1000; Mode /Method: Poisson model; Gaps/MissingData Treatment: Pairwise deletion)。

1.2.4 实时荧光定量PCR 参照TaKaRa SYBR Green qPCR试剂盒实时荧光定量PCR引物原则,设计目的基因qRT-PCR引物。上游引物TaNAC-B072-QF: 5′-ACGTCCACTCCGGCAACAAG-3′；下游引物TaNAC-B072-QR: 5′-CTAAGGCTGGTGGCGATGGG-3′。以小麦的18S rRNA为内参,设计上游引物18S-QF: 5′-GATCCATTGGAGGGCAAGTC-3′；下游引物18S-QR: 5′-GATGCTTGCTTTGAGCACTC-3′。实时荧光定量PCR为20 μL体系: SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) 10 μL、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 5 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 3.8 μL。每个样品设置3个重复。反应在ABI 7500 Real-time System上进行。反应程序为: 95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃34 s,45个循环;在72 ℃时收集荧光信号。根据扩增曲线确定每个基因和样本相应的Ct值,以18S为内参基因,将0 h的表达量设为“1”,采用2-ΔΔCt方法计算TaNAC-B072基因在不同胁迫处理下不同时间点的相对表达量,以及TaNAC-B072基因在成熟根、茎、叶、旗叶、种子中的相对表达量。使用Excel 2003处理数据,利用SigmaPlot 12.0绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 小麦TaNAC-B072 基因的克隆及鉴定

根据TaNAC-B072基因的序列,设计了引物,从小麦中国春的cDNA中扩增到1条长度为978 bp的序列(图1)。TaNAC-B072基因的ORF长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06。TaNAC-B072蛋白具有1个典型的NAC结构域,位于第6～161个氨基酸区间。

D2000： D2000 DNA分子量标准;TaNAC-B072： TaNAC-B072基因的扩增结果。图1 小麦TaNAC-B072基因的克隆结果

2.2 小麦TaNAC-B072基因的生物信息学分析

将预测的TaNAC-B072的氨基酸序列与来自二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,BdNAC72-like:XM_014898637.1)、玉米(Zeamays,ZmNAC59:NCVQ01000009.1)、水稻(Oryzasativa,OsNAC2:XM_015766171.2)的蛋白进行同源蛋白序列比对,结果(图2)显示,TaNAC-B072与BdNAC72-like序列的相似性较高。

图2 TaNAC-B072蛋白序列与其他NAC 蛋白序列的比对结果

将TaNAC-B072与上述蛋白序列,以及拟南芥(Arabidopsisthaliana,AtNAC: NM_001084983.1)、亚麻荠(Camelinasativa,CsNAC72:XM_010449838.1)、油菜(Brassicanapus,BnNAC72:XM_013816142.2)、白菜(Brassicarapa,BrNAC72-like:XM_009145150.2)、萝卜(Raphanussativus,RsNAC72-like:XM_018591561.1)、辣椒(Capsicumannuum,CaNAC72-like:XM_016686297.1)、菠菜(Brassicaoleraceavar.oleracea,BoNAC72:XM_013743297.1)、醉蝶花(Tarenayahassleriana,ThNAC72:XM_010522599.1)、可可(Theobromacacao,TcNAC72:XM_007021266.2)、葡萄(Vitisvinifera,VvNAC72: XM_002284632.4)的蛋白序列进行系统进化树分析,结果(图3)表明,TaNAC-B072与BdNAC72-like的亲缘关系较近。

图3 小麦TaNAC-B072蛋白与其他NAC蛋白的系统进化树分析

2.3 小麦TaNAC-B072基因的组织特异性表达

利用2-△△Ct方法计算小麦TaNAC-B072基因在不同组织中的相对表达量,结果(图4)显示,TaNAC-B072基因在小麦幼嫩的根、幼嫩地上部分和成熟的根、茎、叶、旗叶、种子中均有表达,但表达水平不同,在幼嫩根中的表达水平显著高于在其他组织中的。以TaNAC-B072基因在幼嫩根中的表达量为对照,在幼嫩地上部分和成熟根、茎、叶、旗叶、种子中的表达量分别是幼嫩根中的0.29、0.08、0.37、0.31、0.38和0.93倍。

图4 TaNAC-B072基因的组织表达特异性

2.4 小麦TaNAC-B072基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

分别以未经过处理的小麦根和地上部分为对照,通过实时定量PCR分别检测在高盐(NaCl)、渗透(PEG)和冷(4℃)胁迫条件下小麦根和地上部分中TaNAC-B072基因表达水平的变化。结果(图5)显示：在盐胁迫处理后,TaNAC-B072 基因在根中的表达量明显下降,在6 h时下降到最低水平,在12 h时略上升后又下降;地上部分的表达量随着处理时间的延长而持续上升,在24 h时上升到最高值,之后下降至初始水平。在渗透处理后,TaNAC-B072基因在根中的表达量明显下降,在24 h时下降至最低水平,之后略有上升;在不同时间点在地上部分的表达量小幅波动,在1 h时略有上升,在3 h时下降,之后上升,在48 h时达到最高值。在冷处理后,TaNAC-B072基因在根中的表达量在24 h前明显下降,在24 h后上升至初始水平;地上部分的表达量在3 h和12 h时略有上升,在其它时间点的变化不明显。

图5 基因TaNAC-B072在不同处理下的相对表达量

总之,TaNAC-B072基因的表达受到盐、渗透和冷胁迫的影响,可能在小麦抵御胁迫的信号传导过程中起作用。

3 讨论与结论

本研究利用电子克隆结合RT-PCR的方法,克隆了小麦基因TaNAC-B072；对该基因的序列进行相关生物信息学分析，发现TaNAC-B072蛋白结构中包含1个NAC结构域,具有植物NAC转录因子的典型特征。TaNAC-B072的ORF长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06,属于中性蛋白。系统进化树分析显示, TaNAC-B072蛋白属于NAC转录因子蛋白,与BdNAC72-like蛋白的相似度较高。

利用qRT-PCR技术分析TaNAC-B072基因在小麦中的组织表达特异性,结果发现TaNAC-B072基因在小麦的根、茎、叶、种子中均有表达,但表达量不同,其中在幼嫩根中的表达量最高,在种子中次之,在成熟根中的表达量最低。前人的研究报道显示,油菜的BnNAC5基因主要在茎中表达[31]；番茄的SlNAC3基因在根部、花和果实中的表达量较高[32]。即不同的NAC基因在不同组织中的表达量存在差异,说明不同的NAC基因家族成员可能在不同的组织中发挥作用。

已有的研究表明,多个NAC转录因子基因与生物和非生物胁迫相关[13],参与了植物对胁迫的应答和信号转导。菊花的DgNAC1基因受盐、干旱和ABA胁迫的诱导,DgNAC1基因过表达可提高烟草对盐的耐受性[33];小麦的TaNAC2基因受高盐、干旱和冷胁迫的诱导,过表达TaNAC2基因可以提高植物对盐、干旱和冷胁迫的耐受性[34];小麦根中TaNAC69-1和TaRNAC1的过表达可以增加根的长度、生物量,并且TaRNAC1的过表达可提高植物的耐旱性,在水有限的条件下提高粮食的产量[14,35]。本研究的结果显示,TaNAC-B072基因的表达受NaCl、PEG和冷胁迫的诱导或抑制，其中NaCl胁迫诱导小麦地上部分TaNAC-B072基因的表达,但是抑制小麦根部TaNAC-B072基因的表达;在渗透胁迫下,小麦地上部分TaNAC-B072基因的表达小幅波动,根部TaNAC-B072基因的表达受到抑制;在冷胁迫下,小麦TaNAC-B072基因在根中的表达量先明显下降,之后上升至初始水平，而在地上部分的表达量在3 h和12 h时上升,在其它时间点变化不明显。在小麦的不同组织部位,TaNAC-B072基因的表达对不同的非生物胁迫表现出不同的响应,暗示该基因在不同组织中参与了不同的抗逆信号转导通路。

小麦TaNAC-B072基因的表达受到高盐、渗透和冷胁迫的诱导或抑制,说明TaNAC-B072基因可能参与了小麦对非生物胁迫的响应,但TaNAC-B072基因在小麦中的生物学功能和分子机制,还需要更多的遗传学和分子生物学方面的研究来明确。本研究结果为探索小麦NAC转录因子在植物抗逆中的作用提供了新的候选基因,也为深入探索小麦TaNAC-B072基因的抗逆机理提供了理论依据。