辅助性T淋巴细胞9在慢性丙型肝炎初治患者中的变化及临床意义

王 姣， 田元元， 梁志军

1 海南省人民医院， 海南医学院附属海南医院 a. 感染科； b. 消化内科， 海口 570311；2 博鳌超级医院 感染科， 海南 琼海 571435

直接抗病毒药物(DAA)的问世使慢性丙型肝炎的治疗进入了治愈的时代，但HCV感染慢性化机制尚未完全阐明。辅助性T淋巴细胞9(Th9)是新鉴定的CD4+T淋巴细胞亚群，主要分泌IL-9，PU.1和Foxo1是诱导Th9分化的特异性转录因子[1-2]。Th9在病毒感染中发挥重要的免疫调控作用[3]，但Th9及其分泌的IL-9在HCV感染中的作用尚未完全阐明。因此，本研究分析了慢性丙型肝炎患者Th9水平及其与相关临床指标的关系，观察抗病毒对慢性丙型肝炎患者Th9水平的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年12月-2019年7月于海南省人民医院就诊的慢性丙型肝炎初治患者。入组标准：(1)年龄>18岁且<65岁；(2)HCV RNA和抗-HCV阳性6个月以上；(3)入组前未使用抗病毒或免疫调节剂治疗。排除标准：(1)经影像学(腹部B超、肝纤维化扫描、CT或MRI)和相关实验室检查综合评估诊断为肝硬化；(2)合并其他嗜肝病毒和(或)HIV感染；(3)合并恶性肿瘤；(4)合并心脏、肺、肝脏、肾脏等重要脏器功能不全；(5)合并自身免疫性疾病；(6)孕妇及哺乳期妇女。所有入组患者均接受索磷布韦维帕他韦片(每片含有索磷布韦400 mg和维帕他韦100 mg，吉列德科学公司)1片/d口服治疗，疗程12周。同时，选取同期本院进行健康体检的健康志愿者作为对照组。

1.2 病毒学和生化检测 采用实时定量PCR法检测血清HCV RNA，试剂盒由中山大学达安基因公司提供，检测阈值为100拷贝/ml。采用日本Hitachi公司7170A全自动生化分析仪检测患者肝功能，ALT参考范围为男性12～40 U/L，女性11～35 U/L。

1.3 血浆和外周血单个核细胞(PBMC)的分离 慢性丙型肝炎患者基线和抗病毒治疗结束时分别采集EDTA抗凝外周血10 ml，室温1000 r/min离心10 min收集上层血浆，冻存于-80 ℃备用。下层血细胞使用美国Sigma公司的人淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离PBMC，调整细胞浓度至107个/ml，冻存于液氮中备用。

1.4 流式细胞术检测T淋巴细胞分泌IL-9水平 复苏冻存的PBMC，调整细胞浓度至106个/ml，加入佛波酯(50 ng/ml)和伊乌诺霉素(1 μg/ml)刺激细胞因子分泌，同时加入莫能霉素(10 μg/ml)抑制蛋白转运，刺激培养6 h后收集细胞。将细胞转入FACS管中，加入抗CD3-PerCP(美国BD公司)、抗CD4-FITC(美国BD公司)、抗CD8-APC(美国BD公司)进行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，洗涤后加入破膜固定液，4 ℃避光孵育15 min后加入抗IL-9-PE(美国eBioscience公司)，4 ℃避光孵育30 min，洗涤后加入4%多聚甲醛/PBS固定细胞，使用美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪、采用CellQuest Pro软件获取细胞，采用美国TreeStar公司FlowJo V10软件分析结果。

1.5 ELISA检测IL-9水平 使用武汉碧云天公司的IL-9 ELISA检测试剂盒检测血浆IL-9水平。将血清样本和不同浓度的标准品以100 μl/孔加入检测平板中，封住反应孔，室温孵育2 h，洗板5次后加入100 μl/孔生物素化抗体，封住反应孔，室温孵育1 h，洗板5次后加入100 μl/孔辣根过氧化物酶标记Streptavidin，封住反应孔，室温避光孵育20 min，洗板5次后加入100 μl/孔TMB显色剂，封住反应孔，室温避光孵育15 min，带标准品出现显著颜色变化时加入50 μl/孔终止液，混匀后立即测量A450值，绘制标准曲线，计算血浆中IL-9浓度。

1.6 反转录实时定量PCR法检测PBMC中IL-9、PU.1和Foxo1 mRNA水平 应用德国Qiagen公司RNA提取试剂盒提取PBMC中总RNA。反转录体系(TaKaRa公司PrimeScript反转录试剂盒)：5×缓冲液 2 μl，反转录酶混合物I 0.5 μl，寡聚胸腺嘧啶引物 0.5 μl，随机六核苷酸引物 0.5 μl，总RNA 1 μg，加入不含RNA酶的去离子水调整反应体积至10 μl。反转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。实时定量PCR反应体系(TaKaRa公司TB Green实时定量PCR试剂盒)：TB Green预混Taq酶 10 μl，ROX参考染料 0.4 μl，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，cDNA 2 μl，灭菌水 6.8 μl。PCR反应条件：预变性 95 ℃ 30 s；PCR反应 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。PCR引物序列：IL-9上游引物：5’-CCAGCTTCC AAGTGCCACTGC-3’，IL-9下游引物：5’-TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG-3’；PU.1上游引物：5’-GGAAGCCCGGCTGGATGTTAC-3’，PU.1下游引物：5’-CACCAGGTCTTCTGA TGGCTGA-3’；Foxo1上游引物：5’-ACAGACCAACCTGGCATTAC-3’；Foxo1下游引物：5’-TACGTCCTGATGGGACTTACA-3’；β-肌动蛋白上游引物：5’-CACGAAACTACCTTC AACTCC-3’，β-肌动蛋白下游引物：5’-CATACTCCTGCTTGCTGAATC-3’。采用2-ΔΔCt法以β-肌动蛋白为内参照对IL-9 mRNA相对表达量进行分析。

1.7 伦理学审查 本研究方案通过海南省人民医院伦理委员会批准，批号：省医伦审[2018]91，入组志愿者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入29例慢性丙型肝炎初治患者，其中9例基线ALT正常，20例基线ALT超过正常值上限，所有患者均完成了12周抗病毒治疗，治疗结束时均达到病毒学应答(HCV RNA低于检测下限)，所有患者ALT水平均复常。同时纳入年龄和性别比例相匹配的健康对照者15例，两组基线临床特征见表1。

表1 两组基线临床特征

2.2 两组Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相对表达量的比较 慢性丙型肝炎初治患者和健康对照者外周血Th9(CD3+CD4+IL-9+)典型流式散点图见图1，慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9占CD4+T淋巴细胞比例明显低于健康对照者(P<0.05)(表2)。慢性丙型肝炎初治患者血浆IL-9水平、IL-9 mRNA和PU.1 mRNA相对表达量亦明显低于健康对照者(P值均<0.05)，但Foxo1 mRNA相对表达量在慢性丙型肝炎初治患者和健康对照者之间的差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。而Th9比例、血浆IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相对表达量在HCV基因1b型患者和2a型患者之间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

2.3 慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相对表达量与临床指标的相关性 慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA和PU.1 mRNA与HCV RNA呈负相关(P值均<0.05)(图2)，但Foxo1 mRNA与HCV RNA无明显相关性(P>0.05)，上述指标与ALT水平均无明显相关性(P值均>0.05)。

表2 两组Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相对表达量的比较

2.4 抗病毒治疗对慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA及PU.1 mRNA相对表达量的影响 所有患者完成12周抗病毒治疗后外周血Th9比例和PU.1 mRNA均明显高于基线(P值均<0.05)(表3)，但IL-9水平和IL-9 mRNA相对表达量在基线和治疗结束时之间差异无统计学意义(P值均>0.05)(表3)。

表3 抗病毒治疗对慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA及PU.1 mRNA相对表达量的影响

3 讨论

Th9是一种多效性的辅助性淋巴细胞，可能通过多种信号转导通路发挥免疫保护和促进疾病进展的双重作用[4-5]。Th9及其分泌的IL-9在多种病毒感染性疾病中均发挥重要作用。在寨卡病毒感染的早期，Th9即被活化，分泌IL-9水平显著升高，病程至恢复期时Th9和IL-9水平复常[6]，而Th9的活化可能与中枢神经系统细胞损伤密切相关[7]。Th9和IL-9在急性和慢性HIV感染中表现出完全不同的表达谱，急性HIV感染IL-9水平显著升高，而慢性HIV感染中IL-9水平显著下降[8]。本研究首次检测了慢性丙型肝炎初治患者Th9及相关转录因子的水平，结果发现，慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9细胞比例、IL-9水平及IL-9 mRNA和PU.1 mRNA水平均显著降低，且与HCV病毒载量呈显著负相关。这与在慢性乙型肝炎患者中的研究[9]结果一致，提示高水平的病毒复制可能抑制了Th9的活化和IL-9的分泌，同时，由于Th9和IL-9水平与ALT无显著相关性，提示Th9可能与慢性丙型肝炎初治患者的炎症应答无关，Th9和IL-9水平降低可能不足以发挥免疫保护作用，进而诱导感染慢性化。Th9比例和IL-9水平在不同HCV基因型之间的差异无统计学意义，因此，Th9和IL-9水平的降低可能与不同HCV基因型慢性丙型肝炎患者对治疗敏感性的差异无关。PU.1和Foxo1均为诱导Th9分化的重要转录因子， PU.1是特异性诱导CD4+T淋巴细胞分泌IL-9的细胞因子，而Foxo1不但可诱导CD4+T淋巴细胞分泌IL-9，还可抑制Th17和CD8+T淋巴细胞的分化及IL-9的分泌。因此，Foxo1并非特异性Th9的转录因子[10-11]。本研究发现，转录因子Foxo1 mRNA水平在慢性丙型肝炎初治患者和健康对照者之间的差异无统计学意义，提示Foxo1可能并非调控HCV感染者中Th9的关键转录因子，而PU.1可能是主要发挥调控HCV感染者中Th9分化和活化的作用。

DAA治疗可有效控制HCV复制，在绝大多数慢性丙型肝炎患者中应用后均可达到治愈。新近研究[12]发现，DAA治疗对机体的免疫应答也具有调控作用。DAA治疗不但可恢复急性丙型肝炎患者HCV特异性免疫应答，还可降低慢性丙型肝炎患者外泌体相关microRNA水平，进而增强自然杀伤细胞的脱颗粒，促进杀伤功能[13]，以索磷布韦为基础的有效抗病毒治疗可抑制多种细胞因子和趋化因子的表达，抑制HCV诱导的肝脏炎症[14]。本研究发现，经索磷布韦/维帕他韦有效抗病毒治疗后，所有患者均获得病毒学应答，Th9和PU.1 mRNA相对表达量较基线均显著下降，但血浆IL-9水平和IL-9 mRNA相对表达量在基线和治疗后的则无差异。由于Th9并非分泌IL-9的唯一细胞来源，多种免疫细胞(自然杀伤细胞、固有淋巴样细胞2、浆细胞)均可分泌IL-9[4]，DAA治疗可能无法有效恢复其他分泌IL-9的免疫细胞功能，导致IL-9水平无明显变化，这与慢性乙型肝炎患者经恩替卡韦抗病毒治疗后IL-9水平无显著变化的结果一致[15]。但DAA治疗则可有效恢复慢性HCV感染者外周血Th9活性，发挥一定的免疫调控作用。

综上所述，慢性HCV感染可能抑制Th9活化，有效的抗病毒治疗可恢复Th9水平，Th9可能参与了HCV感染慢性化。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：王姣、田元元负责实验实施，收集数据，入组患者，撰写论文。梁志军负责课题设计，资料分析，修改论文。王姣负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。