牡蛎多糖的提取与纯化

位迎雪 宋 春 刘兴祖 于 潇 卢钰博 李希磊 崔龙波

(烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

地球上丰富的海洋生物资源为人们对新型生物活性物质的发现与研究提供了更多的可能。我国海域辽阔，为我国海产养殖特别是牡蛎养殖提供了便利和优势。牡蛎是我国四大养殖贝类之一，牡蛎肉富含多种营养物质，其中牡蛎多糖作为一种多糖类物质，因其具有提高机体免疫力、对正常细胞没有毒副作用的特点以及多种生物学功能，越来越受到人们的重视。

牡蛎多糖作为多糖的一种重要成分，具有多种功能，发挥免疫调节、抗氧化、抗病毒、保护与修复损伤组织、抗凝血和抗血栓等作用。牡蛎多糖可以通过T淋巴细胞介导免疫应答，参与机体的免疫反应。类胰岛素1号生长因子(IGF-1)是机体生长、发育和代谢的一个重要调控因子，还可以保护细胞免受免疫应激损伤，抵抗炎症。丁佳玉等(2019)利用化学方法将有机硒与牡蛎多糖结合在一起，并用其对肿瘤细胞进行处理，结果发现硒化牡蛎多糖能够有效地清除羟自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，其清除自由基的效果随硒化牡蛎多糖浓度的升高而增加。牡蛎多糖抗氧化作用的机制为其所含的还原性羟基能够捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减小脂质过氧化反应链长度，因而可阻断或减缓脂质过氧化反应的进行，从而起到抗氧化的作用。

有学者认为多糖抗病毒的机制是通过抑制病毒早期阶段的复制，即多糖阻断病毒对宿主细胞的入侵。李江斌等(2009)在对牡蛎多糖抑制流感病毒增殖的研究中发现，牡蛎多糖剂量为2毫克/升时的抑制倍数为8，10毫克/升以上时抑制倍数为32，试验结果表明牡蛎多糖能有效抑制流感病毒的增殖，并且随着浓度的提高效果也明显提升。

牡蛎糖胺聚糖是一种重要的牡蛎多糖，李萌等(2008)通过体外给药的方式检测牡蛎糖胺聚糖对单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用效果，结果发现牡蛎糖胺聚糖虽然不能直接杀死该病毒，但能有效保护被该病毒感染的细胞，抑制病毒的扩增。赵冠华等(2018)研究显示牡蛎多糖能对四氯化碳造成的肝组织急性损伤进行修复，有效缓解肝组织的损伤状态。侯丽等(2014)研究显示牡蛎多糖对酒精造成的急性肝脏损伤有一定的保护修复能力。叶邵凡等(2014)通过实验发现牡蛎多糖可以增强肝组织的抗氧化能力，抑制一氧化氮合酶的活性，从而减少一氧化氮的毒性代谢产物对肝组织造成的损伤，同时能使ATP酶保持活性。

一、牡蛎多糖的提取

利用牡蛎多糖易溶于水而不溶于醇、丙酮等有机溶剂的特点，用化学试剂按照一定的比例和步骤，对新鲜牡蛎材料进行反复提取，从而获取牡蛎多糖。牡蛎多糖的提取主要有3种方法：超滤膜分离法、水提醇沉法和响应面法。

1.超滤膜分离法

由于牡蛎含有多种生物活性成分，如核酸、蛋白质、无机盐及其他糖类物质等，会对牡蛎多糖的提取造成干扰，因此要将这些物质全部清除过滤掉。超滤膜分离法是目前比较常用的利用一定的外压分离高分子物质的方法。采用超滤膜分离法分离牡蛎多糖时，由于在实际操作中选择的条件存在差别，分离效果也存在差异。郑亚旭等(2016)通过单因素和正交试验确定超滤膜分离牡蛎多糖最合适的截留分子量为10千道尔顿，最佳的分离条件为料液温度40℃、压力0.04兆帕、pH 6.0。石璇在采用超滤膜法分离牡蛎多糖时，不仅考虑了分离效率，还将生产成本和滤膜的使用寿命作为参考，其得到的最适分离条件为料液温度30℃、压力0.04兆帕、pH7.0。超滤膜分离法提取牡蛎多糖的过程虽然较为复杂，但所提取的产品杂质含量低、生产设备简单，而且具有不损害分离物质活性、能耗低、无污染、分离效率高等优点。

2.水提醇沉法

水提醇沉法作为中药提取时常用的一种方法，其原理是利用物质在不同浓度乙醇中的溶解度差异而将其分离。黄传贵等(2009)在研究牡蛎多糖的提取工艺时，就采用了水提醇沉法，他们在去除牡蛎粗提取物中的不溶物之后进行抽滤，向滤液中添加乙醇，离心之后回收沉淀，用系列浓度的乙醇和丙酮洗涤沉淀，真空干燥，最终得到醇沉多糖。水提醇沉法可以分离出不同分子量的牡蛎多糖，并且不同分子量的牡蛎多糖可能具有不同的生物学功能，因此水提醇沉法提取牡蛎多糖对于深入研究其生物学功能具有重要的意义。

在水提醇沉法的基础上，利用不同的介质进行提取，结果发现提取效率各不相同。根据介质不同可分为3种方法：室温水提取、热水提取和稀碱提取。室温水提取是在室温条件下搅拌3小时，热水提取则是在60℃热水中磁力搅拌2小时，稀碱提取是加入3%的NaOH溶液后在60℃条件下磁力搅拌2小时，但之后要用稀酸中和至中性。结果发现在室温水提取条件下牡蛎多糖的提取效率及总糖含量最高，并且蛋白质含量最低。所以在利用水提醇沉法提取牡蛎多糖时，在室温条件下搅拌3小时是提取牡蛎多糖的最佳方法。

3.响应面法

响应面法作为各类科学实验中常用的一种工艺优化方法，可以连续地对实验的各个水平进行研究，从而得到更加可靠、合理的结果。牛改改等(2016)利用响应面法优化牡蛎多糖的提取工艺，综合考虑温度、液料比和提取时间之间的相互作用，温度90℃、液料比90∶1、提取时间3小时提取效率最高，有利于提高经济效益。张硕等(2012)在单因素分析的基础之上，利用苯酚－硫酸比色法测定牡蛎粗多糖含量并经星点设计－响应面法优化提取工艺，结果表明最佳的牡蛎粗多糖提取条件为：试验温度81℃、液料比80∶1、提取时间2.9小时。此外，还可以利用超声－微波辅助提取牡蛎多糖，一定的震动频率可以破坏牡蛎细胞膜，促进细胞内有效成分如牡蛎多糖的溢出，再通过响应面法选择最合适的试验温度、料液比、提取时间和超声－微波功率。

二、牡蛎粗多糖的纯化

在牡蛎多糖的提取方法中，除超滤膜分离法外其他方法分离得到的都是牡蛎粗多糖，在后续进行牡蛎多糖的结构和功能研究时，所提取的牡蛎多糖纯度远远达不到要求，因此需要对提取的牡蛎粗多糖进行分离纯化，从而得到更纯的牡蛎多糖。牡蛎粗多糖中对研究影响比较大的主要杂质为蛋白质，因此牡蛎粗多糖的纯化以除去蛋白质为主要目的。

1.sevag法

sevag法对除去游离的蛋白质非常有效，是牡蛎粗多糖的分离纯化中比较常用的一种方法。该法利用化学试剂使蛋白质空间结构改变，降低其在水中的溶解度而析出，再通过离心，得到纯度更高的牡蛎多糖。田振华等(2013)利用酶法、sevag法联合去除蛋白质，对酶解之后的旋蒸液多次用sevag液处理，直到不再产生白色絮状沉淀，经检测蛋白质含量下降至1.21%。sevag法作用比较温和，对牡蛎多糖结构的影响较小，但分离效率较低，需要反复进行多次才能达到理想的效果。利用sevag法去除蛋白质时，sevag的含量、反应物震荡时间、氯仿和正丁醇的比例以及脱蛋白质次数都会影响最终效率，刘玉佳等(2014)通过试验得出最佳的提取条件为：sevag含量1/3，反应物震荡时间为25分钟，氯仿和正丁醇之比为4∶1，脱蛋白质次数为4次。

2.酶解法

酶解法是利用蛋白酶的水解作用，将蛋白聚糖中的蛋白质和多糖分离。由于蛋白质的种类较多，为了广泛而有效地水解蛋白质，通常选用专一性较低的蛋白酶，比较常用的有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。郑亚旭(2017)在利用酶解法纯化牡蛎多糖时，考察了最佳的分离条件，结果发现反应温度41℃、反应时间4小时、酶与底物之比为3∶500时酶解效果最好，牡蛎多糖的产量最高。

牡蛎作为一种营养价值极的海产品，越来越受到人们的喜爱，牡蛎养殖的发展对沿海经济做出了巨大贡献的同时，也为牡蛎多糖的研究提供了丰富的原材料。牡蛎多糖作为一种功能多样的生物活性物质，在多个领域都具有较高的经济价值。目前国内对牡蛎多糖的研究及应用还有待加强，本文可为今后的相关研究提供一定的参考。