原发性胆汁性胆管炎的免疫遗传研究现状

2020-12-20马伟煜邓志华

临床肝胆病杂志 2020年4期

马伟煜，邓志华

山西医科大学第二医院消化内科，太原 030001

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种与自身免疫相关的慢性进行性肝内胆汁淤积，标志性血清学特征是抗线粒体抗体(AMA)的出现伴随多克隆IgM和炎性细胞因子水平的升高(TNFα、IFNγ、IL-1和IL-6等)，PBC的病理学特征是以肝内小胆管为中心的淋巴细胞浸润[1]。PBC自身免疫反应主要是以肝内小胆管上皮细胞线粒体内的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex-E2,PDC-E2)为抗原的免疫应答的激活(T淋巴细胞介导的细胞免疫和B淋巴细胞介导的体液免疫)，这种免疫激活与基因表达密切相关。人类白细胞抗原(HLA)基因复合体是一组与免疫应答相关的基因群，全基因组关联研究(genome wide association study, GWAS)[2-6]揭示了HLA Ⅱ类基因及非HLA基因与PBC患者T、B淋巴系统免疫激活的相关性。

1 PBC与HLA基因

HLA Ⅱ类基因位于染色体6p21，在适应性免疫应答中发挥抗原提呈作用。欧洲、日本和中国的GWAS[2-5]证实了HLA II类基因与PBC显著相关，尤以HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1关系密切，其中HLA-DRB1最具基因多态性，按影响类型分为PBC风险基因和保护基因，前者为：HLA-DRB1*08∶01、DRB1*08∶03、DRB1*04∶05，后者为HLA-DRB1*11∶01、DRB1*13∶02等。

风险基因HLA-DRB1*08∶01与保护基因HLA-DRB1*11∶01是高度同源的等位基因，两者区别是HLA-DRB1*0∶01分子缺乏β链57位点处的天冬氨酸残基，这种缺乏导致HLA-抗原肽复合物不稳定，造成抗原对T淋巴细胞的反复刺激出现T淋巴免疫系统的过度激活。Chow等[7]研究发现，具有HLA-DRB1*08∶01单倍型PBC患者的基因可结合PDC-E2肽序列中的三条肽链(PDC-E2145-159、PDC-E2249-263和PDC-E2629-643)，引发抗原提呈细胞与T淋巴细胞高亲和力的免疫反应，但具有HLA-DRB1*11∶01单倍型健康人与上述肽结合时无明显免疫反应，且其β57-59DEE序列赋予了HLA-抗原肽复合物的稳定性，从而导致免疫耐受以达到保护作用。

基于HLA Ⅱ类分子的α1和β1与外源性抗原肽的氨基酸残基结合诱导T淋巴细胞免疫应答。Umemura等[4]分析了日本PBC患者HLA-DRB1编码的氨基酸残基与PBC易感性的关系，结果显示PBC患者HLA-DRB1*08∶03编码的氨基酸以第13位甘氨酸、第16位酪氨酸和第74位亮氨酸多见，健康人群HLA-DRB1*11、DRB1*13编码的氨基酸以第13位丝氨酸、第16位组氨酸和第47位苯丙氨酸多见，可能是基因编码的氨基酸赋予了PBC的易感性。为了进一步阐明HLA Ⅱ类基因编码的氨基酸与PBC的风险关联，Darlay等[8]对英国11 375例研究对象(2861例PBC患者和8514例健康对照者)的HLA基因和氨基酸多态性进行分析，发现PBC与氨基酸的关联是由基因编码的5个不同位置上氨基酸的变异所决定，并明确了HLA-DPβ1及其分子上氨基酸的变异是主要因素。按氨基酸变异与PBC的风险相关程度由高到低排列如下：HLA-DPβ1 11L/G、HLA-DRβ1 74L、HLA-DQβ1 57D 、HLA-C 156R 、HLA-DQα1-13A。其中，HLA-DRβ1 74L变异发生在HLA-DRB1*08∶01(与欧洲PBC人群密切相关)和HLA-DRB1*08∶03(与日本及中国PBC人群相关)[2-4]，提示不同种族PBC人群HLA-DRB1*08的差异也与其编码的氨基酸变异有关。这些氨基酸具体如何影响免疫系统，需要深入探讨。

另外，HLA Ⅱ类基因编码的氨基酸也与PBC特异性抗体有关，近期关于我国PBC患者自身抗体的GWAS研究[9]显示，HLA-DRβ1-Asn77/ Arg74、DRβ1-Ser37和DPβ1-Lys65是抗sp100抗体产生的主要决定因素，并与风险基因DRB1*03∶01相关性最强。这样的相关性也表明了抗sp100抗体的产生是T淋巴细胞依赖的免疫应答结果，而抗gp210与之无明显关联。

2 PBC与非HLA基因

六次大规模的GWAS鉴定了27个与PBC易感性相关的非HLA基因座[10]，并认为PBC的遗传易感基因存在种族差异，但涉及的基因免疫途径基本相同。与PBC相关的非HLA易感基因[10](IL-12A、IL-12RB2、STAT4、CD80、CD28/CTLA4、TNFSF15、IKFF3-ZPBP2-GSDMB、TNFRSF1A、NF-κB1、CXCR5、IL-21/IL-21R、TNFRSF1A和RPS6KA4等)主要参与针对自身抗原的T、B淋巴免疫系统的激活，进而产生TNFα、IFNγ、IL-2、IL-17、IL-21、IgM、AMA等炎性细胞因子和抗体，最终造成小胆管上皮细胞损伤及肝内胆汁淤积。

2.1 IL-12途径 IL-12途径主要由IL-12及其受体和STAT4组成。IL-12是p35和p40亚基组成的异源二聚体，两个亚基分别由IL-12A和IL-12B基因编码；相应的IL-12受体由IL-12RB1和IL-12RB2组成，分别由位于染色体19p13.1的IL-12RB1和1p31.2的IL-12RB2两个基因编码。STAT4由位于染色体2q32.2-32.3基因编码，主要参与Th1/Th2细胞分化的调控。PBC相关IL-12具体途径[11]为：PDC-E2抗原通过TLR激活抗原递呈细胞，后者在磷酸化的干扰素调节因子5磷酸化后产生IL-12，IL-12通过结合CD4+T淋巴细胞表面的IL-12RB2受体，进而激活NF-κB和STAT4等信号因子，产生Th1炎性细胞因子(TNFα和IFNγ)的T淋巴细胞免疫应答；其中IL-12RB2可被IFNγ上调作为IL-12的正反馈通路，加重胆管细胞的损伤。

GWAS证实了IL-12途径与PBC相关的三个非HLA风险基因是IL-12A、IL-12RB2和STAT4[12]。Li等[13]通过IL-12A的精细定位遗传分析在PBC人群的调控机制，IL-12A 的SNP(rs4679868和rs6441286)是潜在的顺式eQTL(数量性状基因座)，该基因座通过上调IL-12A的表达刺激IL-12途径，直接参与PBC的发生。Wasik等[14]的一项单中心研究发现，IL-12RB2的基因多态性与PBC相关，与健康人相比，PBC患者的IL-12RB2的SNP rs3790567等位基因A和rs6679356等位基因C在肝内过表达，当两者共存时，肝硬化发生的风险显著增加。rs3790567等位基因还与AMA-M2有关，与GG纯合子相比，rs3790567的AA纯合子与AMA-M2的相关性更强、抗体滴度更高，这种相关性充分说明IL-12途径激活的T淋巴免疫系统与B淋巴免疫系统产生自身抗体的必然联系。Joshita等[15]也发现了日本PBC人群的三种STAT4 SNP(rs7574865、rs8179673和rs10181656)与抗核抗体(ANA)具有相关性，但分子免疫机制需要进一步探讨。

2.2 CD28/CTLA4 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA 4)基因位于2号染色体长臂33，编码的蛋白质分为膜性和可溶性CTLA 4，这两种蛋白表达于活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面，作为T淋巴细胞免疫应答的负性调控因子。因此，CTLA 4基因异常导致CTLA 4蛋白的表达失衡，从而降低T淋巴细胞的免疫耐受性。Yang等[16]对PBC人群与CTLA 4基因多态性的Meta分析表明，CTLA 4 SNP rs231775和rs231725的多态性是PBC的危险因素，其中CTLA4上SNP rs231775 的GG、GA基因型以及G等位基因和rs231725 的AA、GA基因型以及A等位基因均与亚洲及高加索PBC人群显著相关，这与Li等[17]和Eskandari-Nasab等[18]研究的CTLA 4基因与PBC相关性的Meta分析一致。

2.3 肿瘤坏死因子15(TNFSF15) TNFSF15也称TL1A, 为位于染色体9q32的基因所编码，与死亡受体3相互作用，并能与IL-12协同促进Th1、Th17细胞的极化。日本GWAS[19]结果显示，TNFSF15在日本PBC人群的易感性最强，具有遗传多态性。Hitomi等[20]通过1279例日本PBC人群的病例对照研究和体外功能分析显示，TNFSF15启动子区的功能性变体rs4979462与PBC相关，并与TNFSF15 mRNA表达水平有关，具体为通过结合核因子(NF-1)上调了TNFSF15的表达，从而增强T淋巴细胞的免疫应答。Sun等[21]进一步对TNFSF15精细定位分析显示，TNFSF15 rs4979462的T等位基因与PBC风险增加显著相关。

此外，TNFα信号通路对NF-κB通路的激活对PBC的基因转录调控起重要作用，欧洲GWAS[22]也确定了参与PBC的TNFα信号传导途径的3个易感基因，分别是TNFRSF1A、DENND1B和TNFAIP2，但是TNFSF15与此信号途径无明显相关。在PBC基因治疗靶点方面，TNFSF15和NF-1可能成为治疗PBC的潜在靶点，需深入研究具体靶向药物及通路。

2.4 17q12-21区域染色体17q12-21包括IKAROS家族锌指3(IKZF3)、透明带结合蛋白2(ZPBP2)、gasdermin-B(GSDMB)和ORM1样蛋白3(ORMDL3)4种基因，其中IKZF3编码Ikaros锌指蛋白，作为转录因子对B淋巴细胞增殖和分化的调节起重要作用；GSDMB编码含411个氨基酸的蛋白质，在促进和维持上皮细胞的终末分化状态起重要作用；ORMDL3编码含153个氨基酸的内质网跨膜蛋白，主要参与T淋巴细胞的活化；ZPBP2编码透明带结合蛋白，具体功能不详。

该区域被日本GWAS[23]鉴定为日本PBC人群非HLA易感基因，其中ZPBP2基因的SNP rs11557467与PBC存在最强关联。17q12-21区域具体如何影响PBC，Hitomi等[24]通过体外功能分析表明，在IKZF3与其上游GRB7之间的基因区域存在FOXO1蛋白，该蛋白的SNP rs12946510是该染色体增强子区域的功能变体，其T等位基因可破坏FOXO1的结合位点，降低ORMDL3和GSDMB的表达水平，导致Th2细胞因子(IL-4、IL-13)水平的降低，降低T淋巴细胞的免疫耐受进而赋予了PBC的易感性；相反，rs12946510的C等位基因可增强GSDMB和ORMDL3的表达，降低了PBC的发生，表明GSDMB和ORMDL3可能对PBC具有负性调控作用。

2.5 CXCR5、IL-21/IL-21R基因滤泡辅助T淋巴细胞(Tfh)是一种具有特征性CXCR 5表达的CD4 T淋巴细胞亚群，在B淋巴细胞的激活和抗体的分泌中起重要作用。Tfh特异性基因CXCR5被欧洲GWAS鉴定为PBC易感性基因，Li等[25]在66例PBC人群的血液中发现，CXCR5+CD4+Tfh数量增加，并且与PBC严重程度显著相关，具体机制可能是其通过接收来自CXCL13-CXCR5轴的趋化信号，并定位于B淋巴细胞进而促进自身抗体及炎性细胞因子的分泌。与此同时，他们还发现了CXCR5+CD4+Tfh细胞通过CD19+B淋巴细胞促进AMA的产生，且能诱导血清和肝内IL-21水平的升高。

IL-21也与PBC密切相关，GWAS将IL-21和IL-21R确定为中国汉族PBC人群的易感基因位点。Qiu等[26]在PBC人群中发现了IL-21广泛表达在门静脉周围和浸润性炎症细胞，IL-21R+广泛表达在受损的小叶间胆管细胞周围，并证实了IL-21/IL-21R通路活化，激活多个下游信号分子(STAT 1和STAT 3)，对T、B、NK细胞的增殖和分化起重要作用。同时，他们还确定了，IL-21的SNP rs925550、rs17005934和IL-21R的SNP rs2189521与PBC显著相关。IL-21不仅受其基因多态性的影响，还与IL-12途径相关联，IL-12能促进IL-21的产生和IL-21+CD4 T淋巴细胞的增加，共同加重PBC小胆管的损伤。

2.6 NF-κB途径 NF-κB是一个由Rel (cRel)、p65 (RelA, NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2) 五个亚单位组成的转录因子蛋白，能与DNA特定区域结合而发挥转录调控的作用。NF-κB中的NF-κB1 / MANBA基因区域位于染色体4q24，与PBC密切相关。Hitomi等[27]在研究PBC的NFKB1/ MANBA区域的主要功能变体中指出，位于NF-κB1内含子11上的SNP rs17032850和位于MANBA内含子10上的rs227361是PBC的遗传易感性基因的功能变体，分别与转录因子淋巴细胞增强因子和和抑制性转录因子视黄醇X受体α结合，从而上调NF-κB1和MANBA的转录及炎症因子的释放，参与了PBC的进展。

PBC风险基因TNFRSF1A、CD80、RPS6KA4和PRKCB也参与了NF-κB途径的活化[28]。其中，PRKCB最近被日本GWAS[29]鉴定为日本PBC人群的易感基因，具体的易感方式是位于PRKCB内含子中的PRKCB rs35015313，通过调节B淋巴细胞抗原受体诱导NF-κB的活化从而影响PBC，但PRKCB的遗传多态性未发现与PBC明显相关，有待更加深入的探讨。

3 治疗

大量证据表明PBC的发生发展涉及多种免疫相关基因，这些基因主要参与T、B淋巴细胞系统驱动的肝内小胆管破坏。现阶段PBC唯一被推荐的治疗药物是熊去氧胆酸(UDCA)，但超过30%的患者对UDCA治疗不应答，研究针对PBC免疫调控的药物可能具有广泛临床治疗前景[30]。目前调控免疫应答的方法包括皮质类固醇激素的免疫抑制以及针对T和B淋巴细胞的靶向免疫调控。

Rautiainen等[31]进行了一项为期3年的多中心随机开放研究，将41例接受布地奈德(6 mg/d)联合UDCA(15 mg/kg)的PBC患者与36例接受UDCA(15 mg/kg)的PBC患者比较，结果显示，3年后前者ALP、ALT、GGT显著改善(P值均<0.05)，且肝脏病理分期Ⅲ期PBC患者的肝纤维化下降25%；后者肝酶虽有所改善，但肝纤维化增加70%，说明布地奈德联合UDCA在改善和稳定PBC肝组织病理方面比单独使用UDCA更有效，证实了皮质类固醇激素布地奈德在PBC的治疗地位，但需考虑到布地奈德的安全剂量及副作用，未来有可能将布地奈德与UDCA联合作为PBC的二线治疗方案。

与免疫抑制剂相比，生物制剂具有特异性免疫调控作用。目前针对PBC靶向免疫调控的生物制剂包括抗IL-12/23抗体(Ustekinumab)、CTLA-4 IgG(Abatacept)和抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)。Ustekinumab是一种人免疫球蛋白IgG1 kappa单克隆抗体，与IL-12/23共有的p40蛋白亚基特异结合阻断T淋巴细胞的激活。Hirschfield 等[32]对20例UDCA反应欠佳的PBC患者在第0、4、12、20、28周皮下注射90 mg Ustekinumab，将治疗反应定义为ALP降低>40%，缓解定义为对于ALP在1.67×ULN～2.8×ULN的患者，ALP降至正常；对于ALP>2.8×ULN的患者，ALP降至<1.67×ULN即可达到缓解。结果显示，第28周35%的患者ALP下降≥20%，且该药物具有改善肝脏纤维化的作用，仍需要进一步研究用量、疗程以及缓解标准，为Ustekinumab在PBC的治疗提供有力的证据。

Abatacept是一种由CTLA-4的胞外结构域和IgG1的Fc结构域片段组成的重组融合蛋白，能特异性结合配体并下调CD28介导的T淋巴细胞免疫应答。Bowlus等[33]一项为期24周的临床开放研究，对16例UDCA治疗欠佳的PBC患者皮下注射Abatacept 125 mg/周，结果显示，在24周内，外周血表达炎性趋化因子受体CCR5的CD4+T淋巴细胞频率减低，表达稳态趋化因子受体CCR7的CD4+T淋巴细胞频率增加，表明Abatacept逆转了PBC患者的T淋巴系统免疫异常。

利妥昔单抗是针对B淋巴细胞表面CD20抗原的鼠-人嵌合单抗，具有靶向消耗B淋巴细胞的作用。Myers等[34]对14例PBC患者在第1天和第15天静脉输注利妥昔单抗(1000 mg)，并随访72周，结果发现，治疗后1周的所有患者B淋巴细胞显著减低，血清IgM和AMA在第6个月时明显下降，分别是3.6 g/L降至2.1 g/L和1∶320降至1∶80。23%的患者在第18个月时，ALP恢复正常或下降幅度≥25%，60%的患者在12个月内瘙痒得到改善，说明选择性消耗B淋巴细胞可导致自身抗体产生减少而减弱自身胆管上皮细胞的破坏。