肝巨噬细胞在原发性胆汁性胆管炎发生发展中的作用

杨文霞， 唐映梅

昆明医科大学第二附属医院 消化内科， 昆明 650000

原发性胆汁性胆管炎(PBC)原称为“原发性胆汁性肝硬化”，2014年-2015年在国内外专家联合声明[1]下更名为“原发性胆汁性胆管炎”。PBC是一种慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病，其病理特征为小叶间胆管上皮细胞进行性非化脓性变性、坏死，及炎性细胞浸润，最终形成胆汁淤积，病情进展可出现肝纤维化、肝硬化；血清学主要表现为抗线粒体抗体(AMA)尤其是抗M2亚型阳性，以及胆汁淤积相关酶学指标,如ALP、GGT的改变，其常见临床表现为乏力、黄疸、瘙痒、高脂血症、骨质减少以及与其他自身免疫性疾病(最常见为干燥综合征)的合并症，约90%见于40～60岁女性，具体发病机制尚未完全清楚[2-3]。在其发病过程中，肝巨噬细胞发挥了重要作用[3]。

肝巨噬细胞包括骨髓来源的单核细胞和常驻于肝脏的Kupffer细胞，Kupffer细胞来源于胚胎时期卵黄囊的红血球样细胞，在胚胎时期即定植于肝脏，能够自我更新。与单核细胞相比，Kupffer细胞是静止的，以微绒毛固定于肝窦内皮细胞的窗孔内，以利于吞噬血源性抗原及衰老红细胞细胞碎片等，在肝脏先天性免疫及内稳态中发挥重要作用[4]。病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，及损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMPs)可激活Kupffer细胞，释放炎性因子和趋化因子，募集循环血液中的单核细胞及中性粒细胞，参与肝脏的固有免疫反应和适应性免疫应答[5]。因此，稳态条件下，Kupffer细胞组成了肝脏吞噬细胞的大部分，炎性条件下肝巨噬细胞则由Kupffer细胞和单核细胞构成[6-7]。Kupffer细胞和单核细胞被证明具有高度不同的功能，特定巨噬细胞亚群的特定功能仍然未知，在PBC中可能也很重要；巨噬细胞的功能异质性和起源的相关性，是目前巨噬细胞领域的研究热点[3,6-7]。

1 PBC单核巨噬细胞浸润及免疫表型的改变

单核细胞占浸润门静脉区域细胞的30%，大多集中在受损胆管周围[8]。在PBC患者的肝脏中，各种单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein, MCP)(如MCP-1、MCP-2和MCP-3)增多；浸润的单核细胞主要以趋化因子受体(CCR)2依赖方式大量募集入肝脏，在PBC晚期阶段更为明显[2]。CCR2缺陷对自身免疫性胆管炎的发展具有保护作用；双重趋化因子受体CCR2/CCR5拮抗剂Cenicriviroc阻断CCR2/CCR5可抑制单核细胞浸润，改善PBC的严重程度，如血清总胆汁酸水平、门静脉炎症和纤维化[2,9]。

外周血单核细胞主要分为CD14highCD16-经典单核细胞群(约占血液单核细胞的90%)和CD16+单核细胞群(约占血液单核细胞的10%)，后者进一步分为CD14highCD16+中间子集和CD14lowCD16+非经典子集；CD16+单核细胞通常被称为促炎性单核细胞。PBC患者具有独特的单核细胞免疫表型。PBC患者外周血CD16+单核细胞明显增加，且CD14lowCD16+细胞的数量与疾病进展呈正相关，与肝损伤指标和血清CRP呈正相关，尤其在肝硬化的PBC患者更为明显，可促进PBC患者的炎症反应和肝损伤；在PBC单核细胞和T淋巴细胞体外共培养模型中，CD14lowCD16+单核细胞可通过IL-12和直接接触促进辅助性T淋巴细胞(Th)1分化，且PBC患者循环中CD14lowCD16+单核细胞与Th1细胞数量呈正相关[10]。CD14highCD16+单核细胞可促进Th17细胞分化并分泌高水平的IL-17，Th17细胞可能在PBC发病机理中起作用[3]。此外，还发现其他分子如唾液酸黏附素在PBC单核细胞异常过表达，唾液酸黏附素在免疫调节及炎症反应中发挥调控作用；介导炎症信号的CD40配体水平在PBC单核巨噬细胞中显著升高[11]。

2 肝巨噬细胞极化在PBC发病中的作用

巨噬细胞具有高可塑性，其表型和功能随着微环境的变化而发生改变。根据局部微环境的改变，巨噬细胞可极化为M1及M2型，M1即经典活化型巨噬细胞，主要由脂多糖(LPS) 和IFNγ诱导，活化后可分泌促炎因子，如IL-12、IL-1、TNFα及促炎介质NO等，具有高效的抗原递呈能力，促进Th1和Th17细胞免疫反应，其杀菌能力增强，发挥促炎、促纤维化及抗肿瘤作用。M2即替代活化型巨噬细胞，可分为M2a、M2b、M2c、M2d四种亚型，主要由IL-4等诱导，活化后可产生IL-10等抗炎细胞因子，能有效吞噬凋亡细胞残骸，促进血管形成、组织修复和重塑，诱导Th2细胞反应，发挥抗炎、抗纤维化及促肿瘤作用，杀菌作用则很弱。正常状况下，M1和M2处于动态平衡中，在炎症反应中能够相互转换；在炎症早期, M1型巨噬细胞释放促炎因子和趋化因子, 招募和激活免疫细胞，但可能造成组织损伤，而在炎症恢复阶段, M1型可转化为M2型巨噬细胞,发挥抗炎效应,参与组织愈合及修复[6,12-13]。PBC中M1/M2的动态平衡被打破，内稳态向炎症方向进展并造成组织损伤，可能参与了PBC的发生发展[14]。

已有研究[14-15]表明，在PBC的早期炎症阶段，巨噬细胞主要向M1方向极化，中晚期肝纤维化、肝硬化阶段，巨噬细胞主要向M2方向极化，M1、M2型巨噬细胞可能参与了PBC的炎症损伤及纤维化。M2/M1的比值在疾病的进展过程中处于动态变化中，在PBC的早期明显低于中晚期，PBC患者血清中M2/M1的比值与胆汁淤积相关指标如DBil、ALP的表达呈正相关，提示M2/M1的比值可有效反应血清中DBil、ALP的浓度；而M1与血清总胆汁酸、ALP呈负相关，M2只与ALP呈正相关。

诸多因素可影响PBC肝巨噬细胞的极化状态。TYRO3、AXL和MERTK受体酪氨酸激酶组成TAM受体家族，其共同配体为生长停滞特异性基因6(Gas6)和S蛋白(ProS)[16]；TAM受体信号系统异常可导致自身免疫性疾病的发生，MER受体为其中最重要的一员。研究[17]发现，MER受体的表达在PBC晚期阶段高于早期阶段，可促进巨噬细胞向M2方向极化，其潜在机制是MER受体通过调控磷酸化蛋白激酶B水平进而增加M2型巨噬细胞诱导因子的表达与分泌,促进M2型巨噬细胞极化。IL-17可通过激活核因子-κB(NF-κB)途径使巨噬细胞向M1方向极化。IL-17主要由Th17细胞产生，Th17细胞大量浸润于PBC晚期患者肝脏中，主要集中在受损胆管周围及汇管区；IL-17发挥促炎和促纤维化作用，是改变PBC肝巨噬细胞极化的关键细胞因子；IL-17可使M1相关炎性因子高表达，M2标志物及相关细胞因子如IL-10的表达则受到抑制，可致PBC的炎症发展[18]；IL-17可能成为PBC的药物治疗靶点之一。此外，最近有研究[19]发现，促胰液素及其受体轴在PBC早期患者表达增加，可促进PBC中M1巨噬细胞极化及炎症损伤。总之，巨噬细胞可通过不同途径活化为不同状态，参与PBC炎症反应，其他促巨噬细胞极化因素有望进一步研究和阐明。

3 肝巨噬细胞中NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protien3, NLRP3)炎性体在PBC发病中的作用

NLRP3炎性体主要存在于巨噬细胞中，由NOD样受体蛋白3、接头分子凋亡相关斑点样蛋白及效应分子前体半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1组成，是迄今为止最典型的炎性小体。多种危险信号可激活NLRP3炎性体，包括细胞内的PAMPs和DAMPs[20]。肝巨噬细胞中NLRP3炎性体的激活可能参与PBC的炎症反应及纤维化。

PBC患者高表达的胃泌素D(gasder-min D, GSDMD)可激活NLRP3炎性体，促进caspase-1、IL-1β与IL-18的释放，促进PBC炎症反应的发生；GSDMD、caspase-1、IL-18在PBC患者中表达明显高于健康对照组。正常情况下，GSDMD蛋白的C端和N端结构域相互抑制，GSDMD处于无活性的自抑状态，NLRP3炎性体激活后释放的caspase-1可水解GSDMD导致N端活性结构域释放，进一步激活NLRP3炎性体，形成恶性循环的炎症反应并导致胆管损伤，可能参与了PBC的发生和发展[21]。

研究[22-23]显示，PBC中NLRP3炎性体的激活有赖于半乳糖凝集素3(galectin-3,Gal-3)。正常肝脏中，Gal-3表达水平很低，主要在肝巨噬细胞中表达；在PBC患者肝脏中，Gal-3 mRNA和蛋白质水平表达增高，其N末端结构域可与NLRP3直接结合并介导NLRP3炎性体的组装和激活，导致caspase-1活性增强及IL-1β分泌，可促进巨噬细胞产生IL-17，这可能参与了PBC的炎症反应及纤维化。Gal-3缺失或Gal-3抑制剂可减轻PBC小鼠模型的胆管损伤[22]。因此，Gal-3或NLRP3炎性体的抑制剂阻断信号传导可能是PBC的潜在治疗策略。

PBC为胆汁淤积性疾病，胆汁淤积时，疏水性胆汁酸如鹅脱氧胆酸可剂量依赖性引起NLRP3炎性体激活以及IL-1β分泌，这可能是PBC炎性巨噬细胞活化的重要机制[24]。此外，G蛋白偶联胆汁酸受体1(G protein-coupled bile acid receptor 1, TGR5)可特异性感受胆汁酸，激活TGR5-cAMP-PKA轴抑制NLRP3炎性体的活化[25]。TGR5是一种胆汁酸受体，在非实质细胞如Kupffer细胞、内皮细胞、胆管上皮细胞等高表达，介导抗炎、抗胆汁淤积和抗纤维化作用[26-28]。TGR5激动剂可改善炎症和胆汁淤积性肝病的发展，TGR5拮抗剂可减弱多囊性肝病和胆管癌的疾病进展，需进一步试验确定TGR5药理活性在相关胆道疾病中的治疗潜力[26]。

4 肝巨噬细胞Toll样受体(TLR)在PBC发病中的作用

TLR为细胞表面的模式识别受体，在机体防御外来微生物感染及先天性免疫反应中起重要作用[29]。TLR4为革兰阴性菌细胞壁成分LPS的模式识别受体，可大量表达于Kupffer细胞等细胞表面；近年来研究[30-31]显示,PBC患者血清LPS水平明显升高；胆道上皮细胞、门静脉区肝细胞以及各种免疫细胞中TLR4表达上调，LPS可激活TLR4，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号传导途径，促进炎性细胞因子如TNFα、IL-1β、IL-6的分泌，可能参与了PBC患者的胆管损伤。此外，研究[11]显示，TLR4及其负调节剂RP105(CD180)的表达在PBC单核细胞上发生改变，使PBC患者单核细胞TLR4通路对LPS反应性增高。研究[31]显示，表达于肝内胆管上皮细胞表面的线粒体M2蛋白可以活化TLR4并以NF-кB途径激活单核巨噬细胞并促进其分泌促炎因子，引起肝内胆管上皮细胞的损伤。PBC患者外周血单核细胞TLR-4 mRNA表达上调，但与血浆中ALP、GGT的水平无相关性，提示TLR4的异常表达和活化可能参与了PBC的发病，但与PBC病情进展无显著相关性[32]。

肝巨噬细胞除了可以表达TLR4，还可以表达TLR2、TLR3、TLR5以及TLR9，这些受体由配体激活后，PBC肝巨噬细胞产生的促炎细胞因子数量明显增加，尤其是IL-1β，IL-6，IL-8和TNFα，这可能与PBC患者自身免疫耐受破坏有关[33]。在PBC患者中，TLR9的高表达可导致B细胞的AMA产生增加；PBC患者TLR3在肝巨噬细胞中高表达，TLR3的配体聚肌胞苷酸( Poly Ⅰ∶C )处理后的PBC小鼠模型可诱导CD8+T淋巴细胞浸润、炎性细胞因子表达及纤维化；肝巨噬细胞可通过TLR3信号传导产生IFNα，IFNα可激活NK细胞并增强NK细胞的细胞毒性[8,34]。调节TLR通路对PBC患者的治疗具有潜在意义。

5 小结

综上所述，肝巨噬细胞具有可塑性，随着肝脏微环境的变化可分化为不同的表型，这些异质性细胞在PBC的发生和发展中发挥不同的作用甚至相互拮抗；肝巨噬细胞可通过模式识别受体TLR及NLRP3炎性体等途径被激活，参与PBC的炎症反应。深入研究肝巨噬细胞在PBC发生发展中的作用，将有利于了解PBC患者炎症及免疫反应机制，最终将改善PBC患者的治疗及预后，肝巨噬细胞在PBC中的作用机制有待进一步研究。