MicroRNA在特发性肺纤维化中作用的研究进展

宋旭东，吴 丹，于 洋，陈培剑，初彦辉

(牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江 157011)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是最常见和最严重的间质性肺疾病，IPF以弥漫性肺泡炎、肺成纤维细胞和肌成纤维细胞大量增殖活化以及细胞外基质的大量沉积为主要特征，最终导致患者肺间质逐渐瘢痕化并出现进行性的呼吸衰竭[1]。IPF被认为是年龄相关性疾病，患者的年龄普遍在60岁以上，且大多数为男性，在没有进行肺移植手术的情况下，患者从诊断之日起中位生存期约为3到5年[2]。

1 特发性肺纤维化发病机制

IPF是一种原因不明的多因素疾病，目前普遍认为是遗传和环境因素相互作用的结果，胃食管反流，烟草烟雾吸入以及金属粉尘、木屑、有机粉尘、二氧化硅粉尘的吸入等都有利于增加IPF的患病率。IPF的发病涉及创伤修复多个通路的异常激活，而肺泡上皮出现损伤和异常修复被认为是肺纤维化的初始过程[1]。IPF的发生和发展可分为三个阶段。第一个阶段是启始阶段，个体的基因变异或突变，导致个体容易患病；此外长期暴露于微损伤环境，如烟草烟雾，病毒感染等，会导致个体出现肺上皮细胞损伤和异常修复，同时导致上皮细胞功能障碍，导致疾病进一步发展。第二阶段是发展阶段，导致上皮细胞功能障碍的多种因素，如内质网应激，生长因子和炎性因子过量分泌等，促使发生上皮-间充质转化，炎性细胞向损伤部位聚集，成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖和活化。第三个阶段是病理阶段，在这个阶段下成纤维细胞在与微损伤环境的反复作用下出现大量增殖活化，最终形成成纤维细胞灶，并且分泌大量细胞外基质，导致肺间质中胶原蛋白和其他细胞外基质大量沉积。以上三个阶段的重复出现，最终导致肺组织逐渐瘢痕化，形成肺纤维化病变灶。

2 MicroRNA和特发性纤维化

2.1 MicroRNA的生物学特征MicroRNA(miRNA)是一种小的内源性非编码RNA，其长度大小约为19到25个核苷酸。目前，在人体中已鉴定发现700多个miRNAs，并且人类基因组可以产生miRNA的位置超过2000处。miRNA参与转录后基因表达调控，单个miRNA可以靶向作用于数百个mRNA,并影响许多基因的表达。miRNA在多种细胞和生理活动中起着关键作用，大量证据表明miRNA和多种人类疾病相关，如心血管疾病，肾脏疾病，癌症等[3]。

2.2 MicroRNA和IPF的相关性许多研究表明，miRNA参与IPF的发病机制。例如，Huang等[4]发现无论是IPF患者还是博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，miR-101表达均下降，并通过实验证实了miR-101可通过抑制成纤维细胞的增殖和活化减轻肺纤维化。另一项研究发现miR-21在博来霉素诱导的肺纤维化模型中升高，并且抑制miR-21表达可以减轻TGF-β诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞发生上皮-间充质转变，这说明miR-21可能通过促进上皮-间充质转变而参与肺纤维化发展过程[5]。

3 MicroRNA在IPF发病机制中的作用

3.1 MicroRNA和肺上皮细胞凋亡在正常的肺组织修复过程中，当Ⅰ型肺泡上皮细胞受到损伤时，会出现Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖，对损伤的部位进行修复。在IPF的肺组织中，由于肺上皮细胞的功能障碍，难以完成对损伤部位的正常修复，致使疾病进一步发展。因此，肺上皮损伤作为肺纤维化的初始过程，干预此过程对预防肺纤维化具有重要意义。Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡是IPF发生和发展的重要因素。在博来霉素诱导的IPF小鼠体内miR-30a出现明显下调，Mao等人[6]发现miR-30a过表达可以抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，其作用机制可能是通过阻断依赖于Drp-1的线粒体分裂。作为甲基胞嘧啶双加氧酶家族(ten-eleven translocation family)重要的成员的TET1基因是miR-30a的靶点之一，miR-30a可以靶向作用于TET1降低其表达。有研究证明TET1 siRNA可以抑制Drp-1启动子羟甲基化[7]。综前所述，miR-30a可以靶向与TET1的3′-UTR结合而抑制其表达，进而干扰Drp-1启动子羟甲基化而参与IPF发展过程。与幼龄的小鼠相比，老龄的小鼠肺上皮细胞中的miR-34a表达明显上升，并且这种上升在博来霉素处理的老龄小鼠的肺中更为显著。miR-34a的上调可以加速肺上皮细胞的衰老、凋亡和线粒体损伤，导致上皮细胞功能障碍，从而促进了老龄小鼠的肺纤维化。p53是重要的细胞衰老标志物之一，Shetty等[8]发现在不同因素诱导的肺上皮损伤和IPF模型中，miR-34a和p53乙酰化表达均增强，同时伴随着沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)表达降低,SIRT1是烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,可使多种蛋白的赖氨酸残基脱去乙酰基。研究发现抑制miR-34a可以促进Sirt1的表达增多，过表达的Sirt1可以降低p53乙酰化的水平，从而达到减缓肺上皮细胞凋亡的效果。因此p53-miR-34a/Sirt1反馈通路可能是治疗IPF的一个潜在途径。

3.2 MicroRNA和上皮-间充质转化上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一个动态的、可逆的生物学过程，在EMT过程中上皮细胞失去了细胞极性和黏附基底膜的特性，随着细胞骨架的急剧变化而改变其形状，并获得了迁移、侵袭和产生细胞外基质(EMC)的能力。EMT在许多肺部疾病中发挥作用，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌和IPF等。在IPF患者的肺上皮细胞中高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)表达增加，HMGA2作为let-7d的一个已知靶点被证明在EMT中发挥着重要作用，并可以促进IPF的发展。let-7d属于let-7家族，是最早发现的microRNA家族之一，其主要定位于肺泡上皮细胞中。在IPF的发展的过程中，肺泡上皮细胞中let-7d表达明显降低。let-7d表达的抑制被认为会促进EMT过程，并增加肺内胶原沉积。Huleihel等[9]向肺成纤维细胞转染let-7d并用TGF-β诱导培养，通过检测发现HMGA2和包括α-SMA在内的间充质标记物表达明显降低。在实验性肺纤化小鼠模型中，miRNA-26a表达出现明显下调，并且miRNA-26的缺失在体内和体外均可以促进EMT的发展。Liang等[10]发现miR-26a可以和HMGA2的3′-UTR端结合，并证实了miR-26a可以通过转录的方式直接调节HMGA2表达。通过向肺上皮细胞转染miRNA-26a，发现过表达miRNA-26a可以抑制EMT和纤维化的形成。因此miRNA-26在肺纤维化EMT发生的过程中可能发挥重要作用，其可能是IPF的潜在治疗靶点。

3.3 MicroRNA和肺部炎症目前，由于抗炎药物在IPF的治疗中效果并不明显，炎症在肺纤维化的发展过程中的作用仍存在争议，但是仍有很多证据表明炎症在肺纤维化的发生和发展中起着重要作用，炎症几乎伴随着整个肺纤维化的发展过程。炎性小体是机体固有免疫的重要组分，在机体的免疫反应和疾病的发生中具有重要作用，在炎性疾病的发展过程中，炎性小体既起着致病作用，又能促进疾病的发展[11]。炭黑纳米颗粒(carbon black nanoparticle,CBNP)是一种超细碳颗粒,它是空气污染如细颗粒物(PM2.5)、汽车尾气等的主要成分。最近的研究显示，当大鼠长期暴露于CBNPs环境下肺部会出现炎症细胞的浸润和明显的纤维化改变。FOXOa3是miR-96的一个作用靶点,相关研究表明叉头框转录因子O3a(forkhead transcription factor 3a,FOXO3a)和NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体的激活呈正相关。Zhou等[12]发现在CBNPs处理的支气管上皮细胞中miR-96表达降低，并伴随着FOXO3a、NLRP3炎性小体和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表的达明显上升，有趣的是,当向细胞中转染miR-96后，上述蛋白表达受到了抑制，这一结果表明了miR-96的缺失可以导致FOXOa3表达上调，从而促进NLRP3炎性小体的激活并加重IPF程度。用脂多糖处理的小鼠肺组织进行HE染色后，发现有明显炎症改变和明显的间充质蛋白水平升高，同时伴随着miR-506的表达水平的明显降低。Zhu等[13]发现无论在体内还是体外，miRNA-506均可诱导细胞凋亡，同时也可以改善炎症反应，除此之外miR-506还可以靶向作用于NF-κB亚基p65的3′-UTR端而降低其表达，而当p65表达受抑制时，肺组织纤维化改变和炎症明显减轻。因此miR-506可能不仅仅是细胞凋亡和炎症的调节因子，也是肺纤维化的重要调节因子。

3.4 MicroRNA和细胞自噬自噬是细胞内主要的降解系统，自噬通过对细胞质、蛋白质和大分子物质的降解以及对分解产物的回收利用，在维持细胞存活和更新中起着重要作用。自噬的过程需要形成一个双膜结构的自噬体，自噬体会包含着被隔离的细胞质物质，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进行内容物降解。自噬可以参与纤维化的过程，同时在纤维化疾病中细胞外基质的降解中也发挥重要作用。人微管关联蛋白1轻链3(human microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)通常用于检测培养细胞和动物组织中的自噬，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是评价自噬活性的常用指标。相关研究发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值在IPF患者和博来霉素处理的小鼠的肺中明显降低，同时p62的表达明显上升，p62的表达水平与自噬的活性呈负相关，这说明了在IPF患者和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠体内自噬水平下降。在纤维化的肺组织和TGF-β1诱导的成纤维细胞中，自噬的活性受到了明显的抑制。miR-449a的表达水平在IPF的过程中是下调的，Han等人[14]发现过表达的miR-449a可以减轻二氧化硅诱导的肺纤维化，此外无论在体内和体外，miR-449a可以诱导自噬活性增强，在此过程中Bcl-2被认为是miR-449a的作用靶点。Beclin1基因是第一个被证明的自噬所必需的人类蛋白质，而Bcl-2被证明可以通过与Beclin1相互作用抑制酵母和哺乳动物体内的Beclin1依赖性自噬[15]。因此miR-449a通过靶向抑制Bcl-2表达可以促进自噬活性增强，从而减轻肺纤维化的程度。

3.5 MicroRNA和肌成纤维细胞分化在正常组织的修复过程中，当组织愈合过程结束以后，肌成纤维细胞收缩活动结束，肌成纤维细胞会发生凋亡。但在IPF的情况下，由于TGF-β因子的过度激活，致使成纤维细胞分化成肌成纤维细胞增多，肌成纤维细胞持续在肺组织中存在，与肺成纤维细胞相比，肌成纤维细胞可以分泌更多细胞外基质和胶原成分，导致肺间质中细胞外基质成分增多，进一步加重肺纤维化[16]。已有证据表明miRNAs在肌成纤维细胞的分化过程中发挥作用。Yang等[17]发现无论IPF患者还是TGF-β1诱导培养的肺成纤维细胞中，miR-145表达都是下降的，向成纤维细胞转染miR-145后发现α-SMA表达增多，同时也促进了肌成纤维细胞灶的形成和纤维粘连。并且抑制miR-145在动物模型中的表达时，减轻了博来霉素诱导的肺纤维化。这些证据说明了miR-145可以调控肌成纤维细胞的分化而参与IPF的发生和发展过程。有研究发现在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞中miR-27-3p表达降低。Cui等[18]发现miR-27-3p可以靶向作用于smad2，smad4和α-SMA蛋白抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，此外miR-27-3p也可以抑制成纤维细胞的收缩，从而避免瘢痕的形成。这说明了miR-27-3p可以通过抑制肺肌成纤维细胞的分化影响肺纤维化发展，其可能是治疗肺纤维化的一个潜在靶点。

3.6 MicroRNA和胶原蛋白生成在正常的肺组织中，胶原蛋白的生成是上皮细胞损伤触发的组织愈合过程的一部分。而在IPF发展的过程中，大量生长因子、细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶参与疾病的进程，过量的基质金属蛋白酶可以破坏基底膜，从而使肺成纤维细胞进入肺泡间隙，在其中增殖并产生胶原蛋白和其他细胞外基质，最终造成细胞外基质异常沉积，进一步促进IPF的发展过程。在发生纤维化的肺组织中，由于成纤维细胞异常增生并分泌大量细胞外基质，大量的Ⅰ型胶原蛋白在肺泡壁内沉积，影响肺泡细胞的通气功能，导致严重的呼吸问题。在IPF的肺组织中，miR-29c的表达明显降低，miR-29c被认为与Ⅰ型胶原蛋白的表达呈负相关。Khalil等人[19]发现成纤维细胞中miR-29的表达下调与组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)的表达降低有关。在IPF患者的成纤维细胞中过表达HDAC4可以恢复miR-29c的表达水平，同时抑制了I型胶原蛋白的表达。Ⅴ型胶原蛋白是一种小胶原蛋白，通常被隔离在肺间质内。在IPF的肺组织中，由于发生组织重塑，导致了Ⅴ型胶原蛋白的暴露和过表达。荧光素报告实验证实了miR-185和miR-186可以直接调控Ⅴ型胶原蛋白的表达。miR-185和miR-186的表达水平与IPF的严重程度无关，但Lei等人[20]发现miR-185和miR-186的过表达可以阻断TGF-β诱导的Ⅴ型胶原蛋白生成。这说明了miR-185和miR-186可以通过阻断Ⅴ型胶原蛋白产生参与肺纤维化发展过程。

4 展望

综前所述，miRNA在肺纤维化的发生发展过程中发挥着重要的作用，这些发现表明了miRNA既可以作为肺纤维化诊断的指标，也可以是肺纤维化疾病的治疗靶点。目前miRNA已被证实了可以通过多种途径抑制肺纤维化的发展，通过调控miRNA的表达治疗肺纤维化可能是一个新的策略。虽然需要进一步的研究去解决miRNA应用于临床治疗技术上的障碍，但纳米技术的发展和miRNA化学类似物的研究有望加速miRNA在肺纤维化治疗上的应用。