二代测序在胰腺癌中的应用

杨野梵 翟博雅 龚予希 张响 张智弘

南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029

【提要】 胰腺癌病死率高，5年生存率仅有8%。PDAC占所有胰腺恶性肿瘤约90%，早期诊断困难，手术切除是其唯一可能的治愈方法，治疗方式一直缺少突破性进展。二代测序(NGS)可以发现PDAC的突变基因，运用NGS的PDAC分子分型提出了PDAC的潜在治疗靶点和发生机制。NGS还可以应用于生物标志物的检测，有助于早期诊断和术后随访。对患者进行NGS检测可以对药物作用靶点进行筛选，提供个体化治疗的可能。

胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，5年生存率仅为8%[1]。 2018年的癌症新发病例中，胰腺癌排名第14位，所导致的死亡排名为第7位[2]。PDAC约占所有胰腺恶性肿瘤的90%，导致其病死率高的原因包括早期诊断困难、缺乏特异性高的生物标志物、发现时通常已处于晚期而缺乏有效的治疗手段等。家族中存在至少两名患有PDAC的一级亲属者患胰腺癌风险几乎是正常人的两倍，多种遗传性疾病也会增加患PDAC的风险[3]。近年来，通过广泛应用二代测序(next-generation sequencing, NGS)中的全基因组测序和全外显子组测序，发现了胰腺肿瘤中的许多基因突变和潜在的治疗位点。

一、NGS在胰腺癌早期诊断和预后中的应用

对于有胰腺癌遗传风险的人群，指南[4]推荐可以通过NGS检测家族性胰腺癌易感基因BRCA2、PALB2、STK11、ATM、PRSS1等和家族性非典型多发黑色素瘤痣综合征的p16种系突变、遗传性结肠癌(Lynch综合征)的MMR基因种系突变、Peutz-Jeghers综合征的STK11基因种系突变，根据测序情况判断是否需要进行胰腺肿瘤的筛查。

通过NGS可以发现能够早期诊断和提示PDAC预后的基因。PDAC的4个散发性胰腺癌驱动基因(KRAS、CDKN2A的p16位点、TP53和SMAD4的DPC4位点)改变的频率最高，这些基因可以作为靶基因进行早期诊断和残留病灶检测[5]。此外，Witkiewicz等[6]发现RBM10突变患者存活时间延长，ARID1A突变患者预后不良，携带MYC致癌基因的8q24基因座扩增与不良预后相关。非编码RNA参与转录后调节或基因表达沉默，失调的非编码RNA可以用作生物标志物进行早期检测。研究者通过NGS发现了许多microRNA和lncRNA在PDAC组和对照组之间存在差异表达。其中miR-802在PDAC中显著下调，miR-93在导管内乳头状黏液性肿瘤(intraductal papillary mocinous neoplasm, IPMN)中显著上调[7-8]。

NGS可用于体液标本检测，达到无创检查的目的。Yu等[9]对115例包括健康者及PDAC、IPMN患者在内的受试者的胰液样本进行数字NGS检测，发现PDAC患者胰液中更容易检测到TP53和(或)SMAD4突变，并且此类突变未在对照组中检测到。突变体TP53和SMAD4浓度可区分PDAC与IPMN病例，灵敏度为32.4%，特异度为100%。值得注意的是，有两例患者在胰腺癌诊断前1年内收集的胰液样本中检测到TP53或SMAD4突变，但影像学并未检测到可疑的病变。同样是基于胰液样品的NGS分析，Kisiel等[10]从表观遗传学水平上检测DNA甲基化。他们发现甲基化CD1D对检测PDAC灵敏且特异，性能优于突变型KRAS。胰液中的甲基化标志物水平不受年龄、性别、癌症阶段或部位的影响。另一项基于手术切除标本的DNA甲基化测序研究发现CpG位点的甲基化与患者存活率相关，FAM150A、ONECUT1、RASSF10等基因甲基化也与患者存活率增加有关，有作为生物标志物的潜能[11]。相较于组织活检，对血液中循环游离DNA(circulating free DNA, cfDNA)分离后进行NGS分析，可降低成本，且可以通过常规抽血，监测肿瘤导致的基因突变的数量和性质。对于未获得足够NGS的肿瘤组织的患者，使用cfDNA的NGS可检测到活检样本90.3%基因突变，诊断准确率为97.7%[12]。研究表明循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是晚期PDAC的独立预后指标，预示手术切除患者无病生存期较短[13]。

NGS作为早期诊断手段，被证明在某些方面优于传统检测方法。大约一半的胰腺囊肿是肿瘤性的，黏液性胰腺囊肿如IPMN和黏液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm, MCN)可以发展为浸润性胰腺导管腺癌[14]，但影像学方法在诊断囊肿性质方面存在局限性。Singhi等[15]进行了一项前瞻性研究，分别用NGS和Sanger测序分析来自595例患者的626个胰腺囊肿液样本，发现NGS检测黏液性胰腺癌的KRAS和(或)GNAS突变具有89%的灵敏度和100%的特异度，高于Sanger测序65%的灵敏度和100%的特异度。NGS联合检测KRAS/GNAS和TP53/PIK3CA/PTEN，对胰腺癌进展的诊断灵敏度可达89%，特异度达100%。2019年的一项荟萃研究比较胰腺囊肿手术患者囊肿液的NGS基因检测和微切片活检的准确性，发现对于恶性和高风险的黏液囊肿，NGS基因检测的诊断准确性高于微切片活检[16]。

二、NGS在胰腺癌分子分型中的应用

研究表明，肿瘤的分子差异可以决定患者预后和治疗效果。Collisson等[17]提出将PDAC分为3种分子亚型：经典型、类间充质型和外分泌型。Bailey等[18]使用RNAseq将PDAC按照分子病理和潜在机制分为4型：鳞型(squamous)、胰腺祖细胞型(panreatic progenitor)、免疫源型(immunogenic)和内外分泌异常分化型。鳞型富含TP53和KDM6A突变，预后较其他类型差。胰腺祖细胞型表达包括PDX1、MNX1、HNF4G、FOXA2等影响胰腺内皮细胞分化和导致青少年的成人起病型糖尿病的基因。免疫源型表现为免疫网络水平总体上调。内外分泌异常分化型表现为影响腺泡细胞和内分泌细胞分化的基因表达上调。除免疫源型为新发现型别，其余3型与Collisson提出的上述3型重合，鳞型对应类间充质型，胰腺祖细胞型对应经典型，内外分泌异常分化型对应外分泌型。分子分型可参与预后判断，一项对518例患者的NGS数据分析发现，胰体尾肿瘤患者的生存率明显低于胰头肿瘤患者，体尾部肿瘤与PDAC的鳞型亚型相关，鳞型亚型患者肝脏复发率高，分化差，肿瘤级别高[19]。Waddell等[20]对100 例PDAC患者进行全基因组测序和拷贝数变异分析，根据染色体结构变化和结构变异事件数量将PDAC分为4型：稳定型、局部重排型、分散型和不稳定型。结果表明局部重排型且包含治疗靶点局灶扩增(如ERBB2、FGFR)肿瘤的患者，以及不稳定型的具有DNA损伤应答缺陷的患者可能对铂和聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase, PARP)抑制剂敏感。

三、NGS在胰腺癌治疗中的应用

PDAC的NGS分子分型虽然尚处于起步阶段，但近年来已经取得了实质性进展，为研究PDAC的治疗提供了帮助。加拿大的COMPASS试验通过全基因组测序和RNA测序，使用经典型与基底样亚型的分子分型方案[21]，发现基底样型对一线化疗反应较差[22]。根据不同分子亚型突变基因的差异，筛选有药物治疗靶点的突变基因，对患者进行个性化治疗。具有种系BRCA基因突变和转移性胰腺癌的患者维持奥拉帕尼(PARP抑制剂)的无进展生存期延长[23]，铂暴露的晚期BRCA相关的PDAC患者的总体生存率提高[24]。针对KRAS的关键下游信号(如RAF)的药物对PDAC治疗有效，使用YAP抑制剂和LY3009120(泛RAF抑制剂)对PDAC治疗显示出显著增强的抗肿瘤效果[25]。Brauswetter等[26]提出将KRAS突变中的G12C突变单独作为一型，因为KRAS G12C突变和低EGFR表达患者对单一MEK抑制剂(曲美替尼)治疗敏感，而其余患者联合治疗更加有效。Waddle等[20]发现肿瘤抑制基因RNF43在10%的PDAC患者中失活，RNF43负反馈抑制Wnt/β-catenin通路信号转导[27]，因此RNF43缺失患者可能会对Wnt抑制性药物敏感。

微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)是由DNA错配修复序列基因缺失引起的，可在1%～2%的PDAC患者中检出[28]。美国FDA批准派姆单抗(PD-1抑制剂) 用于存在MSI的任何实体肿瘤的一线治疗。常规可通过免疫组化检测错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6和(或)PMS2的丢失来鉴定MSI，但是免疫组化受组织固定、染色以及可用组织的限制较大。NGS允许同时对MSI位点进行全面研究，显示突变负荷在PDAC中不均匀分布。因此Hu等[29]建议对转移性或局部晚期PDAC患者，将NGS作为主要诊断检测MSI，以评估是否使用免疫疗法。

有研究者将NGS与基于证据的新型软件工具(治疗图)结合，生成用于PDAC化疗方案的个体化分析[30]。软件基于对原始测序数据的分析检测患者肿瘤的遗传改变，自动搜索先前发表的遗传改变的临床意义，生成治疗图。将分析结果与患者实际化疗结果进行比较。整个分析可在2周内完成，可用于临床常规。这些结果表明基于NGS的软件分析数据可以提供有效、无效和有毒药物的循证信息，可能成为PDAC精准治疗的基础。

四、NGS在胰腺癌中对罕见基因的发现及对治疗的探索

Biankin等[31]对142例PDAC患者进行全外显子组测序后发现，除了已知在PDAC中发生突变的基因KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1，还新发现包括参与染色质修饰的基因EPC1和ARID2的突变，以及体细胞突变基因ATM。ATM基因首先由Roberts等[32]通过NGS在家族性胰腺癌中报道。Waddell等[20]对100 例PDAC患者进行全基因组测序后发现，最常见的PDAC突变基因分别是KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A，他们还发现另外两个首次在PDAC中报道的基因KDM6A和PREX2。Witkiewicz等[6]对109例PDAC进行全外显子组测序，首次发现包括BCLAF1、IRF6、FLG、AXIN1、GLI3和PIK3CA等基因的突变。

家族性胰腺癌(familial pancreatic cancer, FPC)是指患者至少两名一级亲属患有胰腺癌，约占PDAC的10%[33]。有PDAC家族史的人与一般人群相比，患PDAC风险增加且发病年龄提前。了解导致FPC遗传易感性的基因，可以早期检测突变携带者，为个性化治疗提供机会。在NGS被应用于PDAC基因检测前，已发现BRCA1、BRCA2等基因在FPC的突变。FPC中最常见的突变基因是BRCA2，其蛋白质产物是PALB2蛋白的结合配体。Jones等[34]对96例FPC患者进行全外显子组测序后在3例患者中发现了PALB2短缩突变，而1 084名健康者均没有携带此突变，表明PALB2是FPC中第二常见的突变基因，这可能为PDAC的发病机制研究提供新思路。Roberts等[35]对638例FPC患者进行了全基因组测序，结果发现BUB1B、CPA1、FANCC、FANCG、ASXL1、DNMT3A和TET2的有害变异在FPC患者中更常见。这些候选基因有许多参与调节DNA修复或染色体稳定性。

PDAC与糖尿病之间的双向相互作用已经通过流行病学研究得到证实，对26例无糖尿病的PDAC患者和6例合并糖尿病PDAC患者的NGS分析发现13个突变基因(PIK3CD、SNCAIP、IRF4、HLA-A、NOTCH4、PIM1、ETV6、B2M、CD70、PRDM14、TGFBR1、FLT1和PARP2)仅出现在糖尿病组中，主要参与免疫相关通路，可能为探索糖尿病PDAC患者免疫治疗提供新思路[36]。

五、小结

NGS现在广泛运用于基因检测、诊断和治疗中，可检测的标本多样。应用NGS技术观察到PDAC中许多种系和体细胞基因突变，通过对PDAC进行分子分型，发现了许多生物标志物和治疗靶点。NGS可以提供海量的数据，但是仍受读长的限制，质量有待提高，尽管长读长测序可以克服NGS的这一大弱点，但成本相对较高并且通量较低[37]，NGS同时还和其他的技术之间存在竞争。随着NGS技术的进一步发展，将更有助于PDAC的诊断和治疗并最终改善患者的预后。

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