嗜麦芽窄食单胞菌耐药机制及治疗策略的研究

蔺晓萱，谢立新(综述)，霍炳杰，王常乐*(审校)

(1.河北医科大学药学院临床药学2016级，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学基础医学院病原生物学教研室，河北 石家庄 050017；3.河北医科大学第四医院中医内科，河北 石家庄 050011)

嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia，SM)属非发酵型革兰阴性杆菌，广泛存在于医院和自然环境。该菌对多种抗生素天然耐药，但致病能力较弱，多见于感染免疫力低下及危重患者。SM引起人体感染性疾病的易感因素主要包括机体自身和医源性两大类。其中年龄和基础性疾病属于机体自身因素。抗菌药物的使用强度，气管切开或插管、人工置入器材、引流穿刺等侵袭性操作，以及病患住院时间等可作为导致该菌感染的医源性因素[1-2]。SM主要引起人体呼吸系统疾病，但也可引起多种临床综合征，如菌血症、心内膜炎、脑炎及尿道感染等，是医院内感染重要病原体。近年来，该致病菌引起的感染性疾病逐年上升，更由于其天然抵抗多种抗菌药物，给临床治疗带来极大困难与挑战[3]。

1 SM耐药现状

当前，SM耐药现状令人担忧。在临床治疗中，该菌对大多数常用抗菌药物诸如青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青酶烯类抗生素亚胺培南、美罗培南等表现出不同程度的抵抗性[3-4]，且不同医院分离的SM对抗菌药物的耐药率不尽相同。笔者认为其中最直接导致耐药率不同的原因，即标本的来源不同，该原因直接影响着该菌对抗菌药物的敏感性。血液及无菌体液标本分离出的菌株与尿液和其他分离标本中菌株相比，其耐药率较低。回顾性研究显示，自2005—2017年在同一家医院分离出的3 971株SM对米诺环素、左氧氟沙星、和复方磺胺甲噁唑表现出良好的敏感性，且对左氧氟沙星和复方磺胺甲噁唑的耐药性分别从16.5%和14.5%降至4.0%和2.9%[5]。但也有研究报道，2017—2018年临床分离114株SM对复方磺胺甲噁唑的耐药率达到63.16%，必要时需与米诺环素、左氧氟沙星等联合用药以治疗SM导致的感染性疾病[6]。

2 SM耐药机制

SM属多重耐药菌，耐药机制复杂，其所携带的耐药基因可编码多种相关的酶类物质或功能蛋白。这些酶与蛋白发挥着不同的耐药功效，进而降低抗生素对自身的危害。其中，β-内酰胺类水解酶和氨基糖苷类修饰酶属SM分泌的耐药酶类物质。喹诺酮相关的SmQnr决定因子，以及sme基因家族、emrCABsm、smrA和macABCsm等基因编码的多重耐药外排泵属SM编码的耐药功能蛋白。此外，细菌生物膜和可移动基因元件也参与了该致病菌耐药的形成，进而增强SM对不同类别抗生素的抵抗性。

2.1β-内酰胺类水解酶耐药机制 革兰阳性、阴性菌可分泌产生β-内酰胺酶，是致病菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的主要原因。β-内酰胺类抗生素中的β-内酰胺环是抗菌的活性部位，可阻碍细菌细胞壁的合成，进而使得细胞壁缺损，菌体膨胀而死。SM产生的β-内酰胺酶可以与β-内酰胺环结合，在β-内酰胺类抗生素未与细菌作用靶点部位接触之前将其水解失活[3]。SM编码β-内酰胺酶的基因可存在于细菌染色体，也可存在于质粒或插入序列等基因载体，进而能够在不同SM之间传递，从而导致获得性耐药现象的发生[7]。

SM能够分泌产生L1和L2两种β-内酰胺酶，并分别利用Sec和Tat转位酶将L1、L2跨越细菌内膜从细胞质中转运至周浆间隙。L1为金属β-内酰胺酶，以锌离子活性位点为中心。除氨曲南外，L1可水解大多β-内酰胺类抗生素。虽然氨曲南不能被L1水解，但SM仍对氨曲南表现出耐药。因此，该菌或利用其他耐药途径对氨曲南产生抵抗作用[8]。L2为丝氨酸活性酶，具有丝氨酸活性位点，主要水解头孢菌素和单环类β-内酰胺类抗生素，该酶的活性可被碳青霉烯类抗生素亚胺培南诱导产生。L1、L2两种酶的表达可同时受位于L2基因上游的AmpR基因调节，耐药程度与两种酶的表达量有关[3,9]。β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸对抑制L1的活性无效，但可抑制L2 β-内酰胺酶。

2.2氨基糖苷类修饰酶耐药机制 SM分泌与释放的氨基糖苷类修饰酶是导致该菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药的主要原因之一。氨基糖苷类修饰酶按功能可分为三类：乙酰基转移酶类、腺苷酰转移酶类及磷酸转移酶类。三种酶类物质可通过修饰氨基糖苷类抗生素特定的活性基团，导致与细菌靶位核糖体的亲和力降低，从而失去抗菌活性[10]。编码氨基糖苷类修饰酶的基因分布广泛，不但存在于致病菌染色体，同样也存在于细菌质粒的整合子、基因盒、转座子等元件。其中，I类整合子在氨基糖苷类修饰酶基因的传播中起到了重要的作用[3]。不同国家和地区的研究共同显示，住院患者痰液、尿液、咽拭子及其他不同部位分离采集的181株，及血液中分离得到的96株SM中，氨基糖苷类乙酰转移酶基因aac (6′) -lb-cr的检出率分别为5%和4.2%，并对复方磺胺甲噁唑、环丙沙星等抗生素也表现出不同的耐药特性[11-12]。

2.3外排泵耐药机制 外排泵是一类存在于细菌细胞膜起到转运作用的蛋白质复合物。多重耐药菌的外排泵主要可分为五大家族，即：ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)、主要促进剂超家族(the major facilitator superfamily，MFS)、小多重耐药家族(the small multidrug resistance family，SMR)、多药和毒性复合物外排家族(the multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)和耐药-结节-细胞分化超家族(the resistance-nodulation-cell division superfamily，RND)[13-14]。药物进入细菌胞质后，可被上述蛋白外排泵系统排出菌体之外，从而降低药效，导致耐药发生。SM的主动外排泵系统是导致其耐药的重要原因之一[15]。据已有文献报道，该菌所携带的sme家族、emrCABsm、smrA和macABCsm基因，可分别编码RND、MFS、ABC外排泵，进而能够抵抗多种不同类别抗生素[3]。

SM sme家族基因中的smeDEF、smeIJK、smeYZ既属于该菌的天然耐药基因，也可通过其他外源性方式获得。SmeDEF和SmeVWX蛋白被SM sme家族基因编码，是该菌耐药相关的主动外排系统。研究证实，在获得性耐药中，SmeDEF和SmeVWX外排泵的过表达分别与调节因子SmeT和SmeRv的突变有关[16]。smeDEF上游基因编码的SmeT蛋白属于TetR蛋白家族中的转录抑制因子，对smeDEF基因起到重要调控作用。当smeT基因表达下调或失活时，会使得smeDEF基因转录增加，进而导致SM产生多重耐药。Snchez等[16]在SM外排泵过表达的研究中，对SmeT的蛋白结构作出分析：SmeT具有一些与TetR家族中的阻遏蛋白相同的结构特征，但与其他阻遏蛋白不同的是SmeT蛋白中的C端结构域，其主要参与配体结合和二聚作用，而smeT基因突变就发生在二聚作用区域。Gil-Gil等[11]在其综述性文献研究中指出，SM临床分离菌株中的SmeT蛋白氨基酸位点的改变与这些菌株中SmeDEF蛋白的过表达相关，其中Thr197Pro、Leu166Gln、Arg123Lys、Leu144Pro、Arg148Gln及Ala204Glu这6个改变的氨基酸位点广泛存在于SM多重耐药菌株。该文献同样指出，SmeT是植物产生的黄酮类化合物与三氯生的靶点，两种化学物质既能与SmeT蛋白相结合，又能诱导SmeDEF蛋白的表达[11]。除SmeDEF蛋白外，SmeABC蛋白也广泛被证实在SM的耐药过程中发挥关键作用，尤其以该菌外膜蛋白SmeC对抗生素的抵抗最为重要[3]。

2.4喹诺酮与磺胺类抗生素耐药机制 氟喹诺酮类抗生素是一种广谱抗菌药，通过抑制DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ影响细菌正常功能和形态，从而改变细胞壁的多肽成分引起溶菌，以达到杀菌效果。SM编码的DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因的突变是该菌对氟喹诺酮类抗生素产生耐药的主要机制。Margaritis等[12]在其研究中证实，gyrA和 parC的基因突变提高了SM对喹诺酮类药物的耐药水平。影响SM对喹诺酮类药物耐药性的还有该菌染色体编码的Smqnr基因，该基因属于qnr家族，可形成具有类似双链DNA结构的二聚体，保护解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，降低喹诺酮类药物的抑菌活性，产生低水平耐药性[17-18]。

磺胺类药物与细菌二氢叶酸的组成部分对氨基苯甲酸(Para-Aminobenzoic Acid,PABA)的结构类似，能与PABA竞争二氢叶酸合成酶，继而干扰细菌对叶酸的代谢，达到抑菌目的。临床将复方新诺明(磺胺甲噁唑/甲氧苄啶)作为SM的首选治疗药物[19]，该复方制剂能够对叶酸的合成进行双重阻断，继而抑制叶酸的合成。但近年来，也有研究报道明确指出，临床分离SM对复方新诺明表现出明显的耐药特性，在几种测试的抗生素耐药率中排列第二位[6]。SM中的 sul和dfrA基因可以编码二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，使细菌恢复对叶酸的合成能力，从而抵抗磺胺类药物[20]。sul基因有2 个亚型，分别为sul1 和sul2 基因，与插入序列共同区域连锁，能在不同菌株之间进行传递。其中与I类整合素相关的sul1基因是对磺胺类药物产生耐药的主要基因。研究证实，sul1基因与dfrA和sul2基因相结合后能导致SM增强对复方新诺明的耐药水平。此外，I类整合素中所携带的QAC基因(例如smr，qacF和qacH)能够提高SM对复方新诺明的耐药能力[20]。

2.5生物膜屏障 细菌菌群之间可附着在黏膜上皮细胞或无生命材料表面并与之紧密结合，在定植处形成一层膜状结构，即细菌的生物膜。细菌生物膜的形成是一个连续动态过程，即细菌可依赖自身的鞭毛或菌毛附着在宿主细胞或无生命物体表面，通过第二信使环二鸟苷酸及分泌黏性胞外多糖物质降低细菌运动性，增加黏附能力，将菌群彼此之间紧密连接，从而稳固生物膜的形成[3,21]。生物膜在阻断群菌与外界不利环境接触的同时，增加了细菌的耐药性，可通过营养限制、渗透限制等多种机制参与耐药的形成。生物膜在形成过程中产生的黏液性物质将细菌紧密地连接在一起，内部的细菌由于营养物质缺乏，处于休眠状态，抗生素短期治疗对外部细菌具有杀伤作用，但不能有效杀灭生物膜内层的细菌[3,22]。由于生物膜具有渗透屏障作用，其形成的分子屏障和电荷屏障可以阻止抗生素的渗入。生物膜状态下的细菌由于彼此接触密切，在整合子、转座子、接合性质粒、插入序列等的作用下，更易实现耐药基因在细菌间的转化、整合，从而发生水平转移，产生多重耐药[23]。

SM利用可转移的信号因子系统rpf/DSF介导其群体感应系统(quorum sensing,QS)，QS可以通过低相对分子质量信息素在细菌间传递，监测周围环境变化，调节生物膜的形成，继而发挥对抗菌药物的抵抗作用[15,21]。不同研究表明，在形成生物膜后，SM明显增强对抗生素的耐药性[18,23]。临床治疗过程中，由于中央静脉插管、人工植入等创伤性操作，更易导致医院内SM感染及细菌生物膜的形成，为抗生素治疗SM引起的感染性疾病带来困扰。因此，减少使用侵入性的医疗器械及合理、足量、足疗程的使用抗生素可有效清除耐药菌的感染，防范细菌生物膜相关耐药的产生[3]。

3 SM感染的治疗策略

近年来，革兰阴性多重耐药菌在临床引发的感染不断增强。SM作为其中的典型代表，耐药机制复杂多样，对多种抗生素产生强烈抵抗，给临床治疗该菌引起的感染性疾病带来严重困难。因此，在未来的治疗方案中，寻找抗菌药物以外能够有效遏制临床感染性疾病的治疗方法，摆脱单纯依赖现有抗生素的束缚，积极研究与开展安全稳妥的治疗措施，对治疗多重耐药菌引发的感染显得格外重要。

3.1噬菌体疗法 噬菌体是一类寄生在细菌、放线菌等原核细胞型微生物体内的病毒。根据是否裂解感染后的宿主菌，可将噬菌体分为温和噬菌体和毒性噬菌体。由于噬菌体的吸附器官与细菌表面不同受体分子结构的互补性，导致其对宿主菌具有严格特异性和靶向性。20世纪10年代，法国巴斯德研究所科学家Herelle发现了噬菌体感染细菌这一现象。此后，Herelle分别在不同动物体内证实噬菌体能有效抑制细菌感染及降低病死率。在给予4例细菌性痢疾患者和4例淋巴腺鼠疫患者噬菌体治疗后，患者症状逐步减轻并完全康复[24]。至此，关于将噬菌体用于治疗细菌感染性疾病的研究在世界多国逐步展开。

国内、外诸多学者对SM噬菌体同样开展了广泛的研究。McCutcheon等[25]在其团队的多篇文献中报道SM噬菌体DLP1和DLP2 可将Ⅳ型菌毛作为其附着在该菌表面的初级受体。DLP4和DLP5属感染该菌的温和噬菌体[26-27]。文献证实，噬菌体可通过胞溶作用机制治疗SM等临床耐药菌导致的人体感染[28]。目前，应用噬菌体治疗SM感染的基础研究，尤其是在动物试验方面还十分匮乏。2013年，一篇发布在浙江大学学报医学版的文献深入研究了噬菌体SM1治疗SM感染BALB/c小鼠的过程，并通过苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色发现，当感染复数(病毒/细菌数量比)为10-4时，SM1治疗组小鼠的肺、肝组织结构基本正常，且治疗组小鼠全部存活。相反，对照组小鼠被SM感染后，肺组织中广泛肺泡腔淤血，肺泡间隔毛细血管充血扩张，肝组织充血且炎细胞浸润，48 h后全部死亡[29]。这项研究为探究噬菌体治疗临床感染效果提供了良好动物实验依据。

此外，也有文献指出，在未来噬菌体疗法的治疗方案中，可与抗生素联合以发挥二者的协同作用[30]。笔者认为，可通过基因编辑技术将噬菌体改造，使得其以SM各不同类型外排泵系统为受体，在侵入增殖细菌引发裂解的同时，破坏抗生素外排孔道，提高菌体内药物浓度，继而达到清除SM感染的治疗目的。但是，噬菌体疗法在临床的全面应用，仍然是一个较为漫长的过程。在保证治疗安全，降低成本的同时，既要避免噬菌体可能传播耐药基因，同时也需注意宿主菌对噬菌体产生抵抗。

3.2中药抗菌、新型药物与干细胞 抗菌中药种类丰富，成分复杂多样。在临床中，已广泛用于治疗细菌引起的感染性疾病。根据药物的抗菌活性作用于不同类型的细菌，可分为抗革兰阳性和阴性菌中药[31]。已有多篇研究报道显示，中药可通过破坏细菌细胞壁和细胞膜的完整性以改变细胞通透性、影响细菌蛋白及核酸合成、抑制细菌酶活性、提高细菌对抗生素敏感性(逆转细菌耐药)、增强人体免疫系统功能等多个途径发挥抗菌功效[31-34]。目前，中药抑制SM生长的相关研究报道较少，在已知的研究结果中，西青果、黄连、黄芩对临床分离SM菌株的抑制效果显著，但板蓝根和龙胆无抑菌活性[35]。

近年来，新型抗生素和抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)作为抗击细菌感染的新手段受到广泛关注。一大批抗菌谱广泛，能够用于治疗肺炎、腹泻、皮肤及尿路感染等多种感染性疾病的新型抗菌药物，已进入临床三期试验。这些药物既能抑制细菌合成蛋白、细胞壁、DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ和β-内酰胺酶，同时也可以扰乱细胞膜，破坏DNA和细胞[36]。AMPs是一类天然小分子多肽类物质，广泛存在于植物、昆虫、鱼类、哺乳动物以及微生物等体内，可作为第一道防线直接杀死入侵的细菌、真菌、病毒等[37]。阳离子AMPs通常由10～50个氨基酸残基组成，其中短链AMPs的长度为15～20个氨基酸，可通过其携带的正电荷与细菌细胞膜表面的负电荷相结合，进而破坏细菌细胞膜的完整性、抑制细菌细胞内的功能起到直接杀菌作用。此外，抗菌肽还可通过募集和活化免疫细胞，中和细菌产物对炎症反应的抑制、增强核酸识别提高自身炎症反应等方式调节宿主免疫功能，进而清除病原体感染[37]。

干细胞治疗炎症性疾病已在临床研究与应用中展现出良好前景。脏器炎症反应可谓是一把双刃剑，当炎性因子适度产生时，可在宿主防御中发挥有效作用。一旦分泌过量，可成为致病因子加剧宿主组织损伤并导致死亡。研究指出，间充质干细胞能够平衡过度释放的炎性细胞因子，通过分泌趋化因子、白细胞介素及生长因子等，调节免疫细胞的招募、迁移和活化，从而达到调控受损组织炎性微环境的目的[38]。同时，间充质干细胞还具有多向分化潜能，可分化为多种脏器细胞，也可对受损组织进行修复，逆转组织纤维化的发生。

4 结 语

SM具有多重耐药机制，一种机制可对多种抗生素产生耐药效应，且各机制间彼此相互联系，相互影响。分子水平深入揭示该菌耐药机制，有利于设计与研发针对该菌感染的抗菌药物。SM为医院内常见感染病原体，笔者认为在临床治疗过程中应：①合理、规范使用已有及新型抗生素，避免进一步增强SM耐药的可能；②可选择对SM抑菌效果显著的多味中药，按合适比例配药，联合治疗该菌引发的感染；③可根据噬菌体疗法、中药、抗生素、抗菌肽、及干细胞疗法的特点选择组合，彼此配合，彼此互补。研发出一种或多种适于治疗SM及其他临床耐药菌感染的“鸡尾酒疗法”。此外，对医疗器械进行有效消毒，及严格执行无菌操作规程可以有效降低该菌感染的发生率，以减少病原体对患者带来的危害。