肉制品中三甲胺检测方法的应用研究进展

杨睿颖，朱秋劲，白晶，陈玉芹，龙久铃，刘春丽

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025）

三甲胺（trimethylamine，TMA）的分子式为（CH3）3N，分子量59.11，能溶于水、乙醇和乙醚，TMA是一种具有刺激性腥臭味挥发性含氮物质，具有叔胺典型性质，三甲胺有毒，其蒸气遇高温明火即会强烈燃烧爆炸，与汞、氧化剂、酸酐发生强烈反应，对人的嗅觉阈浓度为0.002 mg/L[1]，鱼虾猪肉等肉制品中TMA是由氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）和卵磷脂在酶和微生物反应下降解产生，随着屠宰后肉制品新鲜程度降低，越来越多TMAO转化为TMA，因此TMA是监控肉品质量的重要指标[2]，每个TMA分子中都有一个中心位置的氮原子（N），因此常用三甲胺-氮（trimethylamine-nitrogen，TMA-N）来体现TMA的含量，腌腊肉制品卫生标准GB 2730－2015《食品安全国家标准腌腊肉制品》中规定：火腿中三甲胺氮≤25 mg/kg[3]。

TMA能在人体消化过程中被有效吸收，一部分可转化为致癌的N-亚硝基胺基化合物，另一部分TMA于肝脏黄素单加氧酶的作用下活化成氧化三甲胺（TMAO），经肾脏代谢随尿液排出，有研究表明，TMAO水平与心血管疾病、糖尿病、慢性肾病代谢综合症之间存在联系，检测TMA、二甲胺（dimethylamine，DMA）、以及TMAO的含量可作为临床诊断遗传性代谢紊乱疾病的指标[4]。人群实验中，有心血管病史的人，当血液TMA水平升高时，发生中风，心梗的风险升高1.9倍，TMA会使肾病患者的尿毒症病情和神经毒性加重[5-6]，三甲胺代谢与人体健康关系见图1。

图1 三甲胺代谢与人体健康关系Fig.1 The relationship between trimethylamine metabolism and human health

检测食品中三甲胺的含量，对于控制肉品质量，监管食品安全，保证消费者身体健康有着至关重要的意义。本文对近20年肉制品中三甲胺检测方法的原理、优势以及缺点进行梳理分析总结，为今后肉制品中三甲胺的研究提供一定的参考，各类检测技术对TMA检测的影响见表1。

表1 各类检测技术在检测TMA中的优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of various detection technologies in the detection of TMA

1 分光光度法

分光光度法确定被测物具体成分和浓度是通过测定被测物在特定波长范围内光的吸收度，再由公式和标准曲线计算得出。首先将TMA萃取到苯层，用苦味酸与其进行衍生化反应，试验证明，该化合物在410 nm处有最大吸收波长，于410 nm处用紫外分光光度计测量待测溶液的吸光度，韩书霞等[7]使用分光光度法测定三甲胺含量，利用甲苯萃取，加入无水硫酸钠进行脱水，适当处理完毕后，加入苦味酸使其发生反应导致吸光度改变，配制一系列标准三甲胺溶液用于制作标准曲线，分光光度法测量选择性较好。李宏伟[8]运用分光光度法测定火腿中的三甲胺-氮，改进了原有的方法，参照GB/T 5009.179-2003《火腿中三甲胺氮的测定》标准，并结合多年实践简化试剂处理，重复率较好。

分光光度法存在操作麻烦，耗时较长的缺点，苦味酸与样品中其他胺类物质发生反应，常使测量结果偏高，而且检测过程中用到的甲苯也是高毒试剂，因此在2017年3月食品安全国家标准中，将原本的分光光度法更改为顶空气相色谱法。

2 顶空气相色谱法

顶空气相色谱法是一种联合操作技术，能减少进样口的污染，有效避免杂质对分析的干扰[9]。黄小兵等[10]建立测定鱼肉中三甲胺含量的顶空气相色谱检测方法，探索最佳测定条件：超声处理10 min后，40℃下保温30 min自动进样，第8天开始三甲胺含量明显增多，即开始出现腐败，结果表明，三甲胺在0～40.0 mg/L浓度范畴线性关系良好（R2=0.999 5），样品加标的平均回收率为97.49%～101.79%，检出限为0.1 mg/L，样品的前处理过程如样品顶空处理和色谱条件选择是影响TMA测量准确度的重要因素。有研究者将顶空气相色谱法用于测量河蟹中TMA含量[11]，通过加入强碱试剂氢氧化钠，使顶空瓶内蟹肉中TMA从组织中游离出来，以47mL/min氢气、400mL/min空气、1.5 mL/min高纯度氮气作为载气，采用程序升温方式使沸点不同的组分在合适温度得到分离，使用外标法定量，检测限0.2 mg/L，平均回收率97.02%，目前常用检测器为氢火焰离子检测器（hydrogen flame ionization detector，FID），此外，朱仁康等[12]使用了氮磷检测器（nitrogen phosphorus detector，NPD）。

顶空气相色谱法具有较高的选择性，精确度、重现性良好。色谱条件优化和样品前处理较关键，决定三甲胺能否最大量从样品中释放出来。顶空气相色谱法是三甲胺国家标准检测方法中第二法，适用于水产动物及其肉与肉制品中三甲胺含量检测，但是其仪器昂贵，需专业人员操作，耗时长，不利于基层工作人员和消费群众进行检测。

3 顶空气相色谱-质谱联用法

顶空气相色谱-质谱联用法是一种有机结合分离、定量和定性的技术，色谱主要对样品中的组分起到高效分离作用，质谱则是分析物质相对分子质量和特征结构，气相色谱-质谱联用法提高了准确度，可以在一定程度上减少假阳性和假阴性的出现，此法定性依据在于保留时间和辅助定性定量离子具体信息的确定。周妍等[13]建立顶空气相色谱-质谱联用法测定动物源食品中TMA，定性离子选择响应值较高的3个离子m/z 58、m/z 59和m/z 42，定量离子则选用丰度最高的离子m/z 58，优化试验后选择温度40℃平衡时间40 min。色谱条件选择了强极性色谱柱，用外标法定量三甲胺的浓度为1.0 mg/L～40.0 mg/L时，线性回归方程为y=344 113x-228 785，线性关系良好，相关系数R2为0.999 5，相对标准偏差为2.76%～4.08%。有研究人员分别同时研究了顶空气相色谱-质谱联用法和顶空气相色谱法测量羊肉中的三甲胺，两种方法都同时具有良好的准确度，但当气质条件相同的情况下，试验得出顶空气相色谱-质谱联用法的检测限高于顶空气相色谱法，可以区别10个数量级别的样品。Yan等[14]运用顶空气相色谱-质谱法测定动物源性食品中TMA。选择了强极性柱作为色谱柱，色谱柱初温40℃，保持3 min，升温30℃/min，注射温度220℃；采用外标法定量。结果证明，该方法在浓度为1.0 mg/L～40.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.999 5，检测限为1.0 mg/kg。该方法简便、准确，普适于畜产品中三甲胺的检测。

气相色谱-质谱联用法是目前三甲胺国家标准检测方法的第一法[15]，该法灵敏准确，顶空条件的优化和程序升温条件的选择对于测定结果至关重要，要根据测量物质选择合适的离子源、色谱条件。如果检测结果对于检测限的要求比较高，那么推荐选择顶空气相色质联用法而非顶空色谱法。

4 高效液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱-质谱法作为一种重要的分析方法，应用于各种生化分析当中，液相色谱法适合分析热不稳定、离子型样品。Balio等[16]建立一种测定鱼类中 TMA、DMA 和甲胺（monomethylamine，MA）含量的液相色谱分析方法，明确与溴乙酸叔丁酯反应的最优关键参数（pH8、温度60℃、反应时间60 min）。该方法已在鳟鱼、鳕鱼和大西洋鲭鱼中得到验证，结果表明，在淡水鱼中检出限结果为0.08 mg/kg，在海鱼中检出限结果为1 mg/kg。付雪媛等[17]应用高效液相色谱-质谱联用法测定水产品中三甲胺-N-氧化物，以10 mmol/L铵为流动相A，5 mmol/L甲酸铵，25%甲醇，0.1%甲酸为流动相B，流速为0.8 mL/min，通过单因素试验得出20 eV撞击电压下母离子碎裂表现情况最好，表明在浓度范围5 μg/L～1 000 μg/L内线性关系优良，相关系数为0.999，文中没有对样品进行衍生化，这可能是测试结果异于作者用非抑制离子色谱法测量的结果的原因，当然原因也可能是批次、产地、储藏时间的不同。

利用高效液相色谱-质谱法检测的物质一部分会先进行衍生化，已有文献详细探讨了氯甲酸-9-芴甲酯（fluorenylmethyl chloroformate，FMOC）与胺类物质发生反应的试验条件[18-20]。在涂布FMOC的纤维头同时对样品进行衍生化和萃取比先衍生化再萃取效果良好。高效液相色谱-质谱联用法中流动相的选择和洗脱程序的设定很重要，要根据物质特性选择合适的色谱柱，高效液相色谱-质谱法灵敏度高，方法稳定，特异性强，但是耗时稍长，操作具有一定难度。

5 离子迁移谱法

离子迁移谱（ion mobility spectrometry，IMS）系统一般分为：进样和电离、漂移、离子检测3个主要部分，样品在载气裹挟下到达离子源处被离子化，形成离子脉冲注入迁移管，离子源对IMS的性能具有重要影响。IMS可以在常压电场下对样品分子电离，根据离子迁移率的差异进行分离检测[21]。IMS优点之一是可以在大气压下电离分析物，无需高真空，且检测限低至ng/L，IMS还具有小型化、微型化、速度快等诸多优点，在灵敏度和便利性之间达到了平衡[22]，近年来，随着IMS技术的发展和完善，在食品检测中也逐渐得到应用，如水果表皮的农药残留、牛奶中的三聚氰胺[23]、氯霉素残留物等。

Karpasy等[24-25]讨论微生物菌群和IMS检测结果相关性，在2 min内就可实现对TMA的检测，检测限低至2 ng/kg，离子迁移管载气流速、离子迁移管温度的合理选择至关重要。Wang等[26]利用TMA的良好挥发性和较高质子亲和力建立了一种基于微芯片的强场非对称波形离子迁移谱法（high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry，FAIMS）技术快速检测TMA，15s内完成了测定，TMA检出限为3ng/L，良好的检测限得益于动态顶空温度的选择以及NaOH溶液处理使得TMA最大程度释放，所检测到的离子浓度受顶空采样器温度、载气流量、压力和湿度的影响，其中顶空采样器温度和载气流量分别影响样品分子浓度和透过率[27]。其后外国学者利用顶空-固相微萃取结合IMS[28]，将18-冠醚-6蒸汽作为络合剂，用载气将其带入，解决了需将生物胺衍生化的问题。Cheng等[29]提出了一种基于掺杂辅助正光电离IMS的TMA检测方法。亮点之一是研究掺杂剂种类和漂移管温度对TMA检测的影响并进行优化，以2-丁二酮作为掺杂剂，可更好地分离试剂离子峰和TMA产物离子峰，TMA的检测限低至1 μg/kg，对牡蛎和对虾在4°C贮藏过程中产生的TMA进行了成功评价。

IMS能快速、准确地监测食物中TMA浓度的变化，最快能在15 s内完成检测，较其他方法优势明显，IMS中孵化温度、孵化时间、离子迁移管载气流速、离子迁移管温度是影响离子化效率和响应强度的重要因素。随着IMS的发展，便携式离子迁移谱的诞生让IMS可实现现场快速筛查，玩具中的芳香胺可用IMS在现场快速测定。

6 离子色谱法

离子色谱法（ion chromatography，IC）早于20世纪中叶便由Baumann、Steven利用电导检测器检测离子的电导率，并提出多组分同时测定的优势[30]。在食品安全检测领域中，IC技术优势可以解决常规理化法存在的选择性差、操作步骤耗时等一系列技术难题。Liu等[31]将离子色谱和固相萃取结合起来，作者对萃取条件和离子色谱条件进行优化，将3%乙腈加入到流动相中时，胺的色谱峰不拖尾，合理控制流速才能避免滞后现象，Agilent AccuBond C18柱能有效富集4种胺，回收率高达90%，结果表明TMA、DMA、MA和TMAO 在 0.45 μg/kg～1 000 μg/kg线性范围良好，实际样品中，4种脂肪族胺的回收率均在90%以上。陈帅等[32]运用非抑制性离子色谱方法测量DMA、TMA和TMAO，采用 IonPac CS17柱（250 mm×4 mm）分离，作者研究超声时间对提取效果的影响并优化，检出限分别为 0.030、0.039、0.064 mg/L，该方法具有精密度好的特点。Mark等[33]建立了一种非抑制电导率的离子色谱法同时测定甲胺、二甲胺、三甲胺和三甲胺-n-氧化物的方法，研究了不同色谱参数对分离效果的影响，甲胺、二甲胺、三甲胺和三甲胺-n-氧化物的检测限分别是 43、46、76、72 μg/L。周勇等[34]建立了离子交换色谱-柱后加碱脉冲积分安培检测方法，以此测定冷冻海产品中多腐胺、尸胺、组胺等10种生物胺，样品利用酸溶液提取离心，淋洗液为甲基磺酸，在此酸性流动相条件下，生物胺很难在电化学检测器的金电极上发生氧化还原反应，因此在柱后加入一定浓度的NaOH溶液，并比较了不同浓度的NaOH溶液对生物胺离子在电极上产生电流的大小。

IC相对于IMS耗时较长，检测限的精度也低于IMS，但同样适用于低含量胺物质的检测，离子交换柱和流动相选择决定分离效率和保留时间，柱后衍生可提高响应值。

7 传感器法

传感器由敏感元件和转换元件组成，是能感受化学信息改变（如光信号变化、热信号变化、微量重量变化等），并能将所感受到的化学信息转化为较为直观的电信号的装置。在TMA检测方面，近年来随着气敏部件材料的改进，检测限和精准度重现性都有着飞跃的提升。

在本世纪初研究人员通常利用纳米TiO2制成TMA气敏部件[36]，发现当纳米晶体为15 nm左右时，对TMA具有更高灵敏度，硬脂酸的加入防止胶体粒子发生硬团聚，吸附原理为半导体氧化物TiO2纳米为缺氧型体系，表面吸附氧负离子与三甲胺气体靠化学吸附进行电子交换，当遇到亲核气体TMA就会导致电阻率的下降。Li等[37]首次研究了水溶性聚苯胺的制备，然后用紫外可见光谱和扫描电镜对聚苯胺进行表征，基于水溶性聚苯胺薄膜，研制一种用于检测三甲胺的石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）传感器，三甲胺经预处理后，QCM传感器对三甲胺具有良好的线性关系。经氮气净化后，传感器的响应表现出良好的重复性，聚苯胺敏感元件就很好避免了半导体金属氧化物必须在高达100℃工作的弊端。在此之后，高分子材料修饰的QCM传感器发展迅速，研究人员尝试将高分子材料与半导体金属氧化物结合在一起，Jun FU等[38]研究了基于聚苯胺/TiO2复合材料的QCM气体传感器在不同湿度环境下对三甲胺的响应行为，结果在所有条件下均表现出很好线性灵敏度，同时也表明了传感器因湿度而漂移的规律，建立了不同浓度、不同湿度的数学响应模型，并将该模型用于湿度影响的校正。同时利用贵金属掺杂半导体金属氧化物纳米膜制备三甲胺传感器成为研究热点，研究表明，当含有Au粒子的氧化铟材料处于气体中的时候[39]，Au粒子下方的深度的电子耗尽层就会转化为一个薄层，Au粒子可以对吸附在气敏材料上的氧产生一个很好的分解催化作用，当Au掺杂量为0.9%时，氧化铟纳米膜对待测气体具有最强的敏感度，其值为112。Mitsubayashi等[40]采用黄素单加氧酶作为生物分子识别层，黄素单加氧酶分子通过交联法固定于电极表面。周考文等[41]利用纳米Zr3Y2O9对苯和三甲胺的催化发光有交叉敏感现象，创造了三甲胺测定新方法，检出限为三甲胺（540 nm）0.70 mg/m3和苯（440 nm）0.30 mg/m3。CHEN 等[42]采用石墨烯氧化物（graphene oxide，GO）和氧化亚铜（GO/Cu2O）纳米复合材料制作石英晶体微天平（QCM）气体传感器，采用逐层自组装方法，对浓度为5 mg/L的TMA气体进行检测。传感器响应随TMA浓度线性增加，这与Saurebrey方程一致。在60 d内具有良好的敏感性、选择性、稳定性和可逆性，检测限为0.23 mg/L，是近年来报道的QCM气体传感器对TMA在室温（25±1）℃下的最低检测水平。

传感器在食品领域的应用可追溯至上世纪九十年代，由日本专家提出的鱼新鲜传感器，传感器敏感元件经历了约20年的发展，从单一的半导体金属氧化物到掺杂锌、铜，再演变到掺杂稀土氧化物和贵金属，为克服半导体金属氧化物传感器需要在高至140℃条件下工作的弊端，又出现了以高分子聚吡咯等[43]为代表修饰QCM的传感器，见表2。

开发出更稳定特异性强的气敏材料一直是科研工作者的追求目标，QCM具有高通量、高灵敏度、自动化、阵列化等优势，QCM和石墨烯、印迹材料、复合纳米材料的结合必然成为未来发展方向。

表2 传感器检测TMA近年来发展变更实例Table 2 Examples of TMA for detection methods of sensor

8 毛细管电泳法

毛细管电泳（capillary electrophores，CE）是一种分离效率高、并且样品用量少的分析技术，进样体积只需nL级别，对于珍贵样品优势明显。核心分离原理是样品中各个组分在毛细管中淌度以及分配行为的差异，多用于分析各种生化物质[44]。

Maike Timm等[45]开发了一种快速同时定量鱼肉中氧化三甲胺、三甲胺和二甲胺的方法。整个分析过程可在6 min～9 min完成，检出限为0.04 mmol/L。间接探测方法对没有发生衍生作用的物质如季胺特别有效，此法样品不需要衍生化处理，因而提取过程简单、分析速度快，但影响电渗的因素多种多样，重复性有待提高，而且毛细管光路短、内径太小，使用紫外检测器时灵敏度较低。Lee等[46]研究了毛细管电泳法测定鱼类TMA的电化学发光方法。在TMA的存在下，可以在电极表面产生分析物。使用偏压为1.23 V电势的Pt工作电极在10 mmol/L硼酸钠缓冲溶液中进行电化学发光检测，pH9.2，在 8×10-5mol/L～4×10-8mol/L 范围内，获得用于TMA浓度的线性校准曲线（相关系数R2＝0.999 9）。所获得回收率在98.78%～101.46%范围内，该测量方法成功应用于鱼类中TMA含量的测量。

对毛细管进行预处理可消除长时间进样和溶液蒸发对待测物灵敏度的影响，使试验更加精准。毛细管压强对CE中待测物质的分离，迁移时间及电化学发光强度均至关重要。CE具有成本低、灵敏度高等优点，检测时间一般在10 min～12 min。

9 其他检测方法

拉曼光谱技术成为食品痕量检测的研究热点，表面增强拉曼光谱技术（surface enhanced raman spectroscopy，SERS）解决了拉曼信号强度弱的问题，其原理是将待测物质吸附到纳米金或者纳米银颗粒上，实现信号强度提升上万甚至百万倍，郭小莹等[47]利用SERS建立一种适用于水产鱼制品中组胺含量的快速检测方法，活性基底为银纳米颗粒，其中纳米银颗粒的形态大小，浓缩倍数都是影响拉曼光谱强度重要因素，为进一步增强信号强度将氯化钠溶液加入活性基底，并将4-巯基苯甲酸作为探针检验，结果表明，SERS在1 258 cm-1特征峰处，特征峰与组胺浓度相关系数值可达到0.947 3，检测限为10 mg/L。

酶联免疫层析技术（enzyme-linked immunochrommatography，ELISA）是重要的现场快检方式，最早用于医学检测，ELISA主要是由抗原-抗体特异性结合和显色技术结合形成的快速检测技术，可根据酶和底物反应显色深浅来进行定性和定量检测，酶联免疫试剂盒常用在检测农药以及病毒方面，胶体金免疫层析技术是用胶体金标记抗体，利用特征免疫反应来建立测量的一种方法。许振林等[48]建立一种快速检测酸奶中组胺含量的胶体金免疫层析方法。将直径40 nm的胶体金颗粒与组胺特异性单克隆抗体偶联制备金标抗体，结果显示，最佳反应条件为0.5 mL胶体金、3.6 μL抗体标记、pH 8.8，抗原用量1 mg/mL，出现免疫反应时间为7 min，此方法对组胺的检测限为1.11 mg/kg，但是文中并没有阐述单克隆抗体制备这一关键技术。随着科研的进步，标记物已从单一的胶体金变为金磁复合微粒、荧光微球、量子点材料、上转发光材料，从单一靶标到多靶标高通量发展。

微控流芯片技术，是一种微量分析方法。刘幸等[49]使用固定化的二胺氧化酶制成酶柱作为生物传感器的敏感元件，将微流控芯片与化学发光仪结合作为检测元件，并以鲁米诺-铁氰化钾制成的固定化试剂柱作为化学发光体系，通过流动分析法来检测食品中生物胺的总量。他们在前人研制出的微流控芯片的基础上，将鲁米诺和铁氰化钾这两种化学发光试剂固定于D201阴离子树脂上，装柱，连入化学发光检测系统中，并对检测条件进行了优化，组胺溶液的检出范围为 2 μmol/L～100 μmol/L，检出限 0.5 μmol/L。

质谱法优势之一是无需加热。Mamer[50]测定待测样品中TMA、TMAO含量是运用快原子轰击质谱和稳定同位素稀释法，用质谱法检测到碎片离子峰质荷比m/z 77和质荷比m/z 78。用一系列浓度梯度14N-TMA加入对照品，以浓度为横坐标、离子峰强度之比为纵坐标制作标准曲线，研究表明，其线性关系良好。

10 结语

目前研究表明，顶空气相色谱法是检测肉制品中TMA的主要手段，但是由于当下食品行业市场的需求，这种前处理步骤多、耗时长，检测的精确度受检测技工人员影响比较大的检测方法面临着种种难题，难以应对目前市场检测要求。因此，对于肉制品中TMA的检测，仍需从以下几个方面突破：1）现行食品中TMA检测的国家标准针对范围较为局限，应加快完善和补充，于2017年3月实施针对TMA的检测标准，并没有全部涵盖国家有关制度和法规所陈列的所有项目，因此无法保证相关规定的有效实施。2）2015年10月1日修订后的《食品安全法》第112条款的出台，不仅标志着食品快速检测技术第一次获得了法律地位，而且进一步推动了快速检测技术的研究和发展，相对于大型昂贵仪器，TMA传感器检测技术因为可现场实时检测，免去了复杂过程获得市场青睐，特异性强、灵敏度高、检测步骤简单的传感器快速检查法可有效提高检查效率，在大批量和现场筛选检测中具有广阔应用前景。3）针对目前食品安全风险检测快速化分析、高通量技术要求，新型提取和筛查结构类似物改进仍然是未来研究热点，所以认为更简便、更高效的富集净化模式是前处理研究热点，MOFS和微型化芯片SPME都具有高通量、低试剂消耗和自动化优势，虽然MOFS普遍存在吸附性能不强、稳定性不够、成本过高等问题，但是它具有大的比表面积、可调孔径、结构多样、开放的金属位点和化学可修饰性等诸多优点，在气态分离吸附领域仍是研究重点。4）TMA是“产”出来的，而不是“检”出来的，因而，加强肉制品源头管理，建立科学屠宰、灭菌、运输理念，加强冷链保藏运输，改善冷链销售环境，从源头上减少TMA的产生，可以促进我国畜产品向更安全更环保更健康的方向持续发展。