PCV2免疫调节及遗传变异研究进展

汤智慧，杨 柯，王翠华

(1.汉中职业技术学院，陕西 汉中 723000；2.汉中市动物卫生监督所，陕西 汉中 723102)

1991年在加拿大北部出现由猪圆环病毒感染而流行的疾病，被命名为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningpigsmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)。2004年至2005年初，魁北克的病例急剧增多并在其他地区出现蔓延，主要临床症状有呼吸困难、消瘦、腹泻、体表淋巴结肿大、黄疸等症状[1]，另外还伴有发热、咳嗽、胃炎、神经症状，有时导致突然死亡，严重流行时可增加断奶仔猪的死亡率[2]，给养猪业带来了巨大的经济损失。

猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)为单链环状DNA结构，全基因组大小1.7kb左右。目前PCV包括3个血清型，PCV1、PCV2和PCV3[3]。其中ORF1编码复制相关蛋白(Rep和Rep')，ORF2编码结构蛋白(Cap)，ORF3和ORF4编码参与细胞凋亡和抗凋亡的蛋白[4]。衣壳基因(Cap)是系统发育研究中应用最广泛的基因，应用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)方法将PCV2序列分为5个基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[5]。PCV2的特点是突变率高，易出现基因型优势转移，研究表明疫苗接种可能对其进化产生一定影响[6]。

在受感染猪体的淋巴组织中可以观察到巨噬细胞/单核细胞的数量增多，血液和免疫器官中B细胞和T细胞数量减少，并且产生广泛的病变。PCV2是引发PMWS的重要病因，在世界多地均具有较高的感染率，大多数猪群为亚临床感染，只有一部分动物表现出显性感染[7]。自2007年以来，一些商业疫苗的使用大大减少了PCV2感染造成的经济损失。但是尽管接种了疫苗，病毒仍然在猪群中传播蔓延。

一般情况下，机体对病原体的免疫反应可以清除病原体并产生免疫记忆。而病毒在进化过程中通过一系列机制来规避甚至利用机体免疫系统来完成它们的生命周期。如PCV2能够在宿主体内持续存在，导致机体处于长期的促炎状态，并引起相关免疫病理反应。PCV2感染的结果在不同个体之间又有很大的差异。受PMWS影响，猪体出现严重的淋巴细胞耗竭，从而引起免疫抑制[8]。近年来，关于免疫系统参与发病机制的研究越来越多，PCV2在进化过程中用于逃避免疫防御的机制也越来越多。

1 PCV2感染后的免疫特性

1.1 细胞因子对PCV2感染的免疫调节

非特异性免疫应答是抵御病原体感染的早期屏障，这种反应在病原体侵入后立即被激活。早期反应不能清除病原体，就会引发特异性免疫应答。在防御PCV2入侵过程中，树突状细胞(DCs)起着重要的作用。DCs和巨噬细胞是首先对抗病原体的免疫细胞，它们通过吞噬作用吞噬病原体，并将抗原提呈给T淋巴细胞启动特异性免疫应答，在免疫应答过程中产生I型干扰素(IFN)[9]。起到抗原提呈作用的树突状细胞分为两类:传统树突状细胞(cDC)和浆细胞样树突状细胞(pDC)。PCV2能够调节DC的活性，病毒被DC吞噬，但并不会在这些细胞中活跃地复制，不影响它们的生存[10]。研究表明，PCV2的存在不会影响传统树突状细胞(cDC)的功能，但会影响浆细胞样树突状细胞(pDC)[11]。在病毒的刺激下pDC产生IFN-α，从而产生抗病毒作用。然而，在体外培养的pDCs/单核细胞显示，PCV2可抑制IFN-α的分泌，即使存在IFN-α刺激剂的情况下这种抑制作用仍然存在。而体内感染PCV2反而可以诱导IFN-α的分泌[12]。所以PCV2可以同时具有免疫刺激(体内感染)和免疫抑制作用(体外培养)。研究表明：一方面，病毒可能通过抑制/刺激CpG基序与细胞内胞质或内体受体相互作用来调节细胞因子[13]；另一方面，PCV2封闭的基因组ssDNA(促进作用)和游离dsDNA(抑制作用)复制形式之间的平衡决定了PCV2感染的免疫调节特性[14]。

在免疫调节过程中，另一种起到重要调节作用的细胞因子是IL-10，由固有免疫细胞(如巨噬细胞、DC)和适应性免疫细胞(如B细胞和CD4+ /CD8+T细胞)产生。IL-10能抑制参与病原体清除作用的细胞的活性，如巨噬细胞，Th1 细胞和NK细胞[15]。体内和体外实验均证明IL-10在PCV2感染过程中发挥的重要作用。PCV2可感染体外培养的外周血单个核细胞(PBMCs)，尤其是单核细胞/DC/巨噬细胞群体。IL-10的表达受到PCV2的诱导，PCV2感染PBMCs后释放的IL-10可抑制IFN-γ,IFN-α和IL-12 的表达，这些受抑制的细胞因子是受到具有记忆功能的抗原刺激产生的[16]。实验表明，IL-10在该细胞群中诱导的可能途径通过toll样受体9(TLR9)来控制，TLR9是一种识别非甲基化的内源性表达受体DNA[17]。PMWS感染的猪体胸腺中IL-10的转录水平升高，这与胸腺耗竭和萎缩有关。在PMWS感染的猪群中，由PCV2诱导产生的IL-10是导致免疫紊乱的关键细胞因子，机体IL-10的分泌与PMWS相关，全身IL-10水平与感染后21d血液中的病毒量也有关系。总之，体外实验可以通过识别固有细胞类型，对细胞因子分泌的早期进行研究；体内实验可以研究病毒感染对组织和适应性免疫细胞的影响。实验证实，IL-10是影响固有和适应性免疫应答的重要细胞因子，也是出现PMWS的重要原因之一。

1.2 PCV2感染后的特异性免疫应答

从胚胎到个人发育过程中，关于PCV2引起的体液免疫应答机制研究得较成熟。一方面由于血清样本较容易获得，使用常规方法就能检测出PCV2抗体；另一方面源于疫苗研制过程中对具有免疫原性的衣壳蛋白的深入研究。母畜妊娠期感染PCV2，在妊娠70d左右即可产生针对PCV2的体液免疫应答，并产生特异性抗体[18]。也有研究表明母畜妊娠前感染PCV2，在妊娠期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，并在胎儿体内检测出一定载量的病毒。这一发现对PCV2感染引起流产机制的研究具有重要意义，因为病毒可能仅仅来源于母体，目前还需要更多数据来证明这一发现。出生后，由于在初乳中存在母源抗体，仔猪可以免受PCV2侵袭。中和抗体可以有效地清除病毒并阻碍其复制。这些通过被动免疫获得的抗体,滴度在哺乳过程中会逐渐下降，母源抗体的减少使动物再次易受PCV2感染。然而抗体滴度下降后便会导致PCV2复制的增加、严重的淋巴样病变，甚至引发PMWS[19]。在感染过程中，抗体主要针对Cap蛋白产生，同时也针对非结构Rep蛋白产生。在健康和PMWS感染的猪群中，抗Cap抗体产生较早，且其滴度高于抗非结构Rep抗体。

然而，PCV2抗体对机体的保护作用是有限的，细胞免疫应答的作用也不容忽视。IFN-γ分泌细胞(SC)的发现，已证实其与血清中PCV2病毒载量呈负相关。PCV2特定IFN-γ-SCs为T细胞，在抗原的刺激下能产生够产生IFN-γ,其水平可用来评价细胞免疫功能。在PCV2感染或注射疫苗后IFN-γ产生的量有所增加。并且IFN-γ-SCs对非结构Rep蛋白和结构Cap蛋白的作用都是特异性的[20]。PCV2感染引起的PMWS病猪均出现B细胞和T细胞减少的现象(包括B淋巴细胞和CD3+CD4+、CD3+CD8+记忆/活化的Th淋巴细胞的减少)。另外，疫苗接种和感染都会诱发记忆/活化Th细胞的产生。抗原特异性记忆T细胞在病毒感染和疫苗接种后长期存在，再次接受抗原刺激后能够快速扩增并产生细胞免疫应答来对抗PCV2的感染。在疫苗接种或病毒感染后，产生的PCV2特异性CD4+T细胞，能够产生IFN-γ和TNF-α，这些细胞因子在抵御和清除PCV2感染过程中发挥了重要作用。研究表明，所有接种疫苗或受PCV2感染的猪体内均产生了这些细胞因子，但是特异性抗体的产生率仅仅不到45%[21]。这些结果进一步强调了细胞免疫在防御和清除感染动物PCV2中的重要性。

2 PCV2病毒的变异

PCV2是引起猪群疾病重要的猪病原体之一，严重阻碍养猪业的发展。目前，PCV2疫苗广泛应用于大型农场，在一定程度上产生了免疫效应，但无法完全抵御PCV2的感染，病毒仍然出现持续传播的趋势。在接种疫苗的猪群中，PCV2复制比(R0)约为1.5，而在未接种疫苗的猪中(R0)为5.2。因为R0测量的是个体感染病毒后感染水平的平均值，R0 > 1表示该病原体在种群内持续存在。因此，PCV2疫苗在降低感染力方面非常有效，但不能清除环境中出现的病毒[22]。

通过系统进化分析，依据Cap基因将PCV2分为五种基因型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[23]。早在2000年，PCV2a是农场中发现的最广泛流行的基因型，随即被PCV2b基因型取代并且引起了严重的PMWS暴发。PCV2c最初在丹麦发现，农场的发生概率比较低。PCV2d已经出现，有人认为其显性基因型新的转移可能会持续进行。据估计，PCV2b和PCV2d出现于大约20年前，与出现全球性PMWS爆发的时间吻合。基因型遗传趋异分析反映了不同基因型在猪群中流行的时间，PCV2a遗传趋异程度最高，其次是PCV2b和PCV2d。各个基因型间的全基因组差异约为8% ～ 12%，其中PCV2c差异最大，其次为PCV2d。几种基因型的衣壳蛋白氨基酸序列差异在6% ～ 15%之间[24]。PCV2的变异性由其高变异率决定，自然选择进一步加速了其变异速度。事实上，由于Cap基因的突变，新的抗原变异已经出现。新一代测序技术已经测定出低频突变，低频突变体不适合在既定环境中生存，但会形成储存体，使病毒快速适应不断变化的外界环境。有时可能发生有益突变，并迅速增加它们在病毒种群中的分布。Rap基因具有较高的保守性，而Cap基因具有较大的变异性。研究表明，来自不同猪群的多克隆血清与来自单一基因型的隔离群相比，前者具有不同水平的中和抗体。另外，在Cap蛋白中发现了几个线性表位(25-43、69-83、113-127、117-131、169-183和193-207残基)和构象表位(47-85、165-200和230-233残基)[25]。这些区域包含了在阴性和阳性选择下的位点，尤其是非保守位点处于阳性选择状态，被认为是宿主免疫系统的靶向位点。PCV2蛋白中的保守结构域是其功能的关键区域，这些区域中的位点发生的任何突变对病毒都是不利的。

目前的研究正在进一步了解疫苗接种对PCV2进化的长期影响。一些事实表明疫苗的接种可以促进PCV2的进化。在美国、德国和西班牙等重要的生猪生产国，疫苗接种得到了广泛的应用，据统计90%以上的动物都接种了疫苗。但是由于猪群的密度很高，任何传染病都能迅速传播。此外，由于疫苗不能完全预防PCV2的感染，尽管接种了疫苗，农场中PCV2仍在继续蔓延传播。已有证据表明，在接种疫苗和未接种疫苗的农场中发现的PCV2种群在其基因组组成上存在差异[26]。此外，接种疫苗的猪群中也发现了新的PCV2d分离株，并且这些感染的猪群患有PMWS。实验证明，针对PCV2a的疫苗对PCV2d是有效的。目前，仍需要更多的工作来研究疫苗接种在病毒进化过程中的作用，特别是在接种疫苗的动物中出现疾病的病例。

3 小结

大多数猪体都有有效的免疫机制来清除或抑制PCV2的感染。未感染PCV2的健康猪群通过体液和细胞免疫应答来清除并限制病毒。中和抗体的滴度与PCV2复制增加、严重淋巴样病变和PCV2系统性疾病(PMWS)的发生有关。自然感染或接种疫苗后，抗原特异性细胞能长期存活，并能在抗原识别记忆性T细胞控制PCV2 感染中起重要作用。但是，仍有一定比例的猪群可能无法抵抗感染并发展成PMWS。如今，有效的疫苗接种可以在一定程度上控制疾病的发展。接种疫苗可以启动免疫系统，当遇到PCV2病毒时，可以迅速有效地激活免疫应答。由于疫苗并不能完全预防PCV2感染，考虑到病毒的突变能力，在疫苗接种的情况下出现PCV2的进一步进化是非常有可能的。另外，疫苗的接种对PCV2的进化产生一定影响，并出现新的分离株。