流行性腹泻病毒分子生物学研究进展

（温氏食品集团股份有限公司/国家生猪种业工程技术研究中心，广东云浮 527400）

1971年，猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）在英国被首次发现，随后迅速传至西班牙等其他欧洲国家[1]；1982年，日本发现PED，随后在中国、韩国等亚洲国家相继有PED流行的报道[2]；2010年，我国暴发PED，该病的广泛传播给我国乃至世界养猪行业造成巨大的经济损失[3]；2013年，美国首次暴发PED，经分析发现该毒株与中国分离的AH2012毒株同源性高达97%～99%。如今，PED已经成为一种世界范围内的流行病。感染猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的哺乳仔猪及保育猪死亡率极高，因此研究PEDV的病原学、病毒基因组特性、感染机制等，为预防PED以及疫苗研发提供新的思路与参考。

1 病原学

1.1 病毒粒子形态结构

PEDV为尼多病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronaviridae）成员[4]。PEDV有囊膜，囊膜表面有18～23 nm纤突，呈花瓣状，由核心向四周呈放射状分布，纤突末端呈球状；该病毒直径约为95～190 nm，为单股正链、不分节段RNA病毒。PEDV基因组大小约为28 kb，编码7个开放阅读框 （ORF1a，ORF1b，ORF2～6）[5]。ORF1a、ORF1b编码病毒聚合酶，ORF3编码非结构蛋白并且可能与PEDV致病性相关；ORF2、ORF4～6分别编码病毒纤突糖蛋白（S，150～220 kDa）、次要嵌合蛋白（M，20～30 kDa）、主要嵌膜蛋白（E，7 kDa）以及核衣壳蛋白（N，58 kDa），PEDV整个基因组的编码顺序为：5’UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR[6，7]。

1.2 基因型

由于冠状病毒RNA酶缺乏校正活性，因此病毒在复制的过程中不能保证基因组的保真性，从而导致了病毒遗传具有多样性。目前，常以PEDV的S或S1基因（1～735 aa）进行血清分型或基因分型。目前已知的PEDV仅有1个血清型，但是根据S基因可以将PEDV分为2个基因型，分别为：1型基因群（G1，主要为经典型）以及2型基因群（G2，主要是野毒株或暴发流行毒株）；每种基因群中均可分为2个亚型，分别为G1a与G1b亚型，G2a与G2b亚型。G1基因群G1a亚型包括经典的毒株，如疫苗毒株CV777等已经适应细胞生长的毒株；G1b亚型包含中国、美国、韩国、欧洲近期的变异分离毒株。G2基因群包含全球的野毒株，细分为G2a与G2b亚型，主要是亚洲当前毒株或北美及亚洲大暴发流行毒株；G2b亚型毒株可能是由G1a毒株亚型毒力位点突变引起的[8]。

与CV777毒株相比较，PEDV G2毒株的S蛋白在N端高变区存在氨基酸的插入和缺失（55～56氨基酸位点、135～136氨基酸位点分别插入4个氨基酸以及1个氨基酸，160～161氨基酸中缺失2个氨基酸）。除此之外，韩国、中国等流行毒株（MF3809与FL2013）为G2毒株S蛋白基因突变产生的新毒株[9]。

G1b毒株是从流行的毒株中分离出来的，但新型的G1b变异毒株在分子遗传学上与G1a毒株、G2毒株显著不同，G1b毒株不包含G2野毒株S基因发生变异的典型特征。以S蛋白三分之一N末端基因进行基因进化树分析显示，G1b毒株与G1a经典毒株的同源性为95%，与G2流行毒株的同源性低于89%。对于PEDV S基因其他部分进行分析表明G1b毒株与G2野毒株的同源性超过99%；PEDV全基因组进化分析结果表明G1b亚型毒株与G2流行野毒株亲缘性相近[10]。

2 PEDV编码蛋白及其生物学功能

PEDV基因组编码7个开放阅读框，ORF1a与ORF1b编码12个非结构蛋白（Nsp1～7，9～13），主要参与病毒的复制过程；ORF2、ORF4～6分别编码4个结构蛋白（S，M，E，N），主要与病毒的抗原表位有关或病毒表面结构蛋白或核衣壳蛋白相关[7]；ORF3编码非结构蛋白，是PEDV唯一的辅助因子，可能与病毒的毒力有关，但其具体功能尚不清楚。

2.1 结构蛋白

2.1.1 纤突蛋白S（S蛋白）

S蛋白由1 383个氨基酸组成，属于Ⅰ型糖蛋白，大小约180～200 kDa，是病毒粒子表面的糖基化纤突蛋白，含有病毒粒子的主要抗原表位。S蛋白包含4个部分，分别为信号肽区（1～18 aa）、4个中和表位（499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa以及 1 368～1 374 aa）、1个跨膜结构域 （1 334～1 356 aa）以及1个短的胞浆区（1 357～1 383 aa）。S蛋白是PEDV的主要表面抗原，在调节宿主细胞受体蛋白与病毒的相互作用中起着重要的作用，并能介导病毒进入宿主细胞，最为重要的是可刺激宿主产生中和抗体。因此，S蛋白可以作为疫苗和抗病毒药物开发的靶点[11]。

S蛋白主要以三聚体的形式锚定在病毒粒子表面，并且通过S1（1～789 aa）结构域和S2（790～1383 aa）结构域介导细胞黏附及膜融合。当宿主细胞膜受体与病毒粒子S1受体结合位点结合后，经一系列的细胞反应，激活信号肽上酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。S1区域内包含着PEDV的主要抗原表位，S1蛋白C末端结构域（CTD）与宿主细胞膜上的氨肽酶N（APN）相互作用诱导中和抗体产生[12]。但也有研究者使用PEDV S1结构域内的N末端区域（NTD231-501）利用大肠杆菌表达出PEDV S蛋白的N末端区，经动物实验证明，口服的蛋白可与小肠上皮细胞中的M细胞特异性结合，可诱导分泌产生高滴度的特异性抗体IgA，表明该区域可以作为疫苗作用的候选区域，为疫苗的研发提供新的思路[13]。通过对各种冠状病毒的S序列进行分析发现，S2序列较S1序列更加保守，S2为膜融合的亚单位，包括HR1和HR2两部分，研究发现HR1与HR2相互作用的肽段可以抑制病毒进入细胞[14]。

2.1.2 糖基化膜蛋白（M蛋白）

M蛋白长度为681 bp（编码226个氨基酸），是病毒粒子包膜最为丰富的蛋白，在病毒装配以及出芽的过程中起到重要作用。M蛋白基因较为保守，可以将其作为分子生物学诊断的靶基因。M蛋白具有3个跨膜结构，在病毒的外部带有短的氨基末端结构域，在病毒的内部含有较长的羧基末端结构域[15]。糖基化膜蛋白可用于 PED 血清学诊断[16，17]。

2.1.3 核衣壳蛋白（N蛋白）

N蛋白长度为1 326 bp（编码442个氨基酸），分子量约55～58 kDa，存在6～7个潜在的磷酸化位点，主要组成PEDV的衣壳蛋白。N蛋白具有高度的保守性，分为3个保守的结构域：C端结构域、中间结构域、N端结构域，其与基因组RNA形成RNP复合体并且参与病毒的复制和转录[18]。N蛋白是全基因组中的相关磷酸化蛋白，其抗原决定簇是诱导机体免疫的重要组成成分，可诱导强烈的细胞免疫反应[19]；N蛋白免疫机体后可引起系统免疫和黏膜免疫，可作为免疫增强剂或分子佐剂[20]。

N蛋白可以通过封闭NF-κB通路，抑制IFN-β及IFN-λ的产生，诱导细胞凋亡[21]。PEDV N蛋白通过延长细胞周期的S期从而抑制肠上皮细胞的生长，刺激上皮细胞高水平表达IL-8，促进炎症反应[22]。

2.1.4 小糖膜蛋白（E蛋白）

E蛋白长度为231 bp，编码76个氨基酸，是PEDV病毒粒子中最小的结构蛋白，主要定位在内质网内。E蛋白能够引起内质网应激和NF-κB的激活，能上调IL-8和Bcl-2的表达[23]，主要在病毒的复制和出芽过程中起重要作用。

2.2 非结构蛋白

ORF3是由224个氨基酸组成的非结构蛋白，是PEDV中唯一的辅助性蛋白，重量约25 kDa。ORF3能够编码一种具钾离子活性的通道蛋白，同时通过影响病毒向细胞外的释放而调节病毒的繁殖[24]。ORF3与PEDV细胞适应性及病毒毒力相关，改变ORF3基因可以提高PEDV在体外细胞内的适应性并且减弱病毒的毒力，ORF3可以作为PEDV适应细胞培养并且毒力减弱的标志[25]。研究人员利用反向遗传手段构建出含有不同毒株ORF3的感染性克隆，结果显示含有完整的ORF3蛋白抑制病毒在细胞中复制，而将ORF3基因截短或者对ORF3基因进行点突变可以缓解这种效应；研究还发现ORF3基因中L81区域在构建感染性克隆中拯救PEDV中发挥重要的作用，同时该区域在病毒感染宿主起关键性作用[26]。

PEDV复制酶编码序列占病毒全基因组的2/3，由ORF1a和ORF1b 2个开放阅读框组成，2个开放阅读框之间有46 nt的重叠区域，重叠区域中存在1个滑动序列和1个假节结构。该假节结构能引起滑动序列发生-1位核糖体移码翻译，最终形成2个多聚蛋白（PP1a和PP1ab）。PP1a和 PP1ab被内部蛋白酶水解成Nsp1α、Nsp1β和Nsp2～12，最终加工成为16个非结构蛋白（Nsp1～Nsp16）。PP1ab在病毒感染早期发挥重要作用，主要是对负链RNA、前导RNA、亚基因组RNA和子代病毒RNA进行转录，并切割多聚蛋白产生功能性蛋白[3，27-29]。

3 PEDV感染宿主机制

冠状病毒有广泛的宿主（主要为哺乳动物），如人类、蝙蝠、鲸鱼以及鸟类等，但是每一种病毒限定在特定的宿主范围或者是只感染自然宿主。此外，冠状病毒对呼吸道以及肠道上皮细胞、巨噬细胞有明显的趋向性。

3.1 PEDV感染细胞机制

PEDV的感染具有组织受限性，病毒只在天然宿主的小肠绒毛上皮细胞或肠细胞中复制增殖。猪小肠上皮细胞表面表达的PEDV细胞受体——猪氨肽酶N（pAPN）。PEDV S蛋白的S1结构域是识别pAPN受体的表位，两者通过直接膜融合将病毒转运至靶细胞，病毒脱壳后将核酸释放至细胞质中[12，30，31]。PEDV除了在天然宿主的原代靶细胞中可以进行培养外，还可以使用Vero和 MARC-145细胞进行体外培养[32，33]。在使用Vero细胞系分离PEDV时，使用胰酶预处理，将S蛋白分割成S1与S2 2个亚基，促进PEDV与细胞相结合，确保将病毒的核酸释放至细胞内，从而保证病毒的复制以及体外繁殖扩增。然而，一些细胞减毒PEDV毒株（SM98-1毒株和83P-5毒株）可以在不使用胰蛋白酶预处理的情况下在细胞系中繁殖[30，34-36]。

由于病毒只能在细胞中扩增繁殖，其可调节细胞因子或者信号传导途径，以便病毒本身适应在宿主细胞中的自身繁殖。蛋白组学分析显示PEDV感染Vero细胞参与的细胞凋亡，信号转导和应激反应信号通路蛋白的表达均受到影响。PEDV通过不依赖半胱天冬酶的线粒体凋亡诱导因子（AIF）途径在体内或体外诱导细胞凋亡。PEDV通过激活3种主要的促丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应感染细胞，主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）以及c-Jun N末端激酶（JNK）[37，38]。此外，PEDV还可以诱导ER应激并激活NF-κB途径。PEDV感染宿主细胞并参与复制的过程依赖于多细胞内的过程，体外感染PEDV细胞外的刺激会出现如细胞凋亡、MAPK信号传导以及ER应激等信号通路[22，23]。

3.2 PEDV致病机制

绝大多数研究认为PEDV经消化道系统感染宿主，并主要集中在小肠绒毛上皮细胞中进行增殖，感染后的猪肠道上皮细胞死亡致使绒毛缩短、绒毛上皮细胞消化吸收功能下降，最终引起猪只出现腹泻、呕吐、厌食等临床症状，持续时间大约1个星期。病毒感染小肠绒毛顶端和两侧的上皮细胞导致细胞凋亡，肠道上皮绒毛变短、肠道萎缩，导致腹泻。由于仔猪肠道的细胞较成年猪只肠道细胞更新较慢，因此PEDV感染后，仔猪肠道细胞（更新约1周左右）出现大量死亡后呈现透明症状，致使仔猪无法吸收营养物质而出现腹泻、呕吐等现象而死亡；成年猪只肠道细胞（更新为1～2 d）更新较快，在坏死的肠道上皮细胞脱落后，会有细胞补充，出现一过性的呕吐、腹泻、厌食等症状一过性的感染，病死率较低。感染PEDV的仔猪可以通过RT-PCR和IHC技术在肺脏、肝脏、肾脏以及脾脏中检测到[39]。

近期研究表明，PEDV也可以通过呼吸道感染宿主，空气中的PEDV病毒进入鼻腔，在鼻上皮细胞中积累并传播。树突状细胞（DC）作为抗原递呈细胞，可能在病毒进入鼻粘膜并转移至CD3+T细胞中起作用。携带病毒的T细胞通过淋巴细胞再循环进入血液并到达肠道，引起典型的猪流行性腹泻症状[40]。

4 展望

在过去的20～30年里，PEDV已经给养猪产业造成了一定的困扰。2013年北美发现PEDV后，蔓延至整个美洲大陆，此后多个国家和地区均有PED病例的相关报道。尽管研究学者已经在病原学、免疫学、流行病学以及疫苗免疫学取得一定成就，但是大部分研究是在PEDV传播至北美后开始的。

PEDV暴发以来，危害程度愈演愈烈，其主要原因是没有有效的疫苗与药物。目前，PEDV的致病机理尚未明朗，严重阻碍了有效药物的研发，临床上绝大部分使用经典毒株CV777疫苗免疫猪群，但效果一般；部分生产工作者使用自家组织灭活苗或者返饲等方法进行本场猪群的免疫接种，采集母猪乳汁检测发现可产生较高滴度的IgA，可有效保护仔猪免于感染PEDV。因此，PEDV免疫接种的关键在于毒株，免疫接种时了解当地的流行毒株，选择适当的疫苗株进行免疫接种。

根据国内外的研究进展，PEDV有以下几个方面研究亟待加强：①加强PEDV流行病学调查，分离新毒株并进行基因组学与蛋白组学研究；②加强PEDV病毒分离方法及技术研究，部分专家提出PEDV的基因组可能与病毒的分离密切相关，因此可将基因组学应用至PEDV分离方法研究中；③加强PEDV感染细胞机制的研究，深入研究病毒融合细胞机制，探讨结构蛋白与非结构蛋白在细胞融合中发挥的具体作用；④加强PEDV感染宿主后介导的宿主免疫应答机制的相关研究，探讨PEDV在宿主体内产生的免疫相关研究，阐明宿主抗病毒机制以及PEDV免疫逃逸机制；⑤加强新型疫苗研究，利用新型载体尤其是黏膜免疫相关载体进行研究，充分发挥黏膜免疫相关功能；⑥加强PEDV相关结构域的功能，如S1 N端或C端结构域诱导产生的的免疫反应等。