雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵条件的优化

郭霄飞，李艳婷，王志伟，张 程，郭 尚

（1.山西农业大学山西功能食品研究院，山西太原030031；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

本试验以菌体干质量、菌球形态、多糖含量为指标，探索了雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的最适条件，包括培养温度、装液量、摇床转速和生长周期，旨在通过优化发酵条件，为雁北嗜蓝孢孔菌产品的开发提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雁北嗜蓝孢孔菌菌株由山西省农业科学院食用菌研究所提供（保藏编号为SXSYJJZ No.1510）。

1.1.2 主要试剂 葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、维生素B1、维生素B2、海藻糖、硫酸镁、PDA粉、苯酚等。

1.1.3 主要仪器设备 电子分析天平（MS104TS）、电磁炉（C21-SDHCB16）、高压灭菌锅（SM830）、恒温摇床（CRY-100B）、pH分析仪（ST3100）、热风循环烘箱（WKH-1-A）、光照恒温培养箱（GXZ-1000A）、紫外可见分光光度计（TU-1810PC）、离心机（FC-5706）、电热恒温水浴锅（DZKW-D-2）。

1.1.4 培养基 固体培养基为PDA粉、自来水。水烧开后，将PDA粉溶入沸水中，使其沸腾1～2 min，装入试管（18 mm×180 mm）及三角瓶中，每只试管装10 mL，每个三角瓶的装入量不超其容积的2/3，装好后经121℃、105 kPa灭菌30 min，备用。液体培养基为海藻糖20 g/L、豆粕粉35 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸镁0.25 g/L、维生素B1100μg/L、维生素B2500μg/L、玉米粉3 g/L、植物油1 mL/L、琼脂粉1 g/L，pH值为8.0。将豆粕粉在沸水中煮沸20 min（期间不时地搅拌，以避免糊锅），煮好后使用3层纱布过滤2次，弃去滤渣，将其他营养物质溶于滤液中，加水定容后按试验设计装入培养瓶中进行灭菌，灭菌操作同PDA培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 液体发酵的培养方法 将雁北嗜蓝孢孔菌菌株接种于试管中，在培养箱中避光培养，待菌丝长满斜面后，从斜面上挖取黄豆大小的菌块接入平板中培养；待菌丝长满平板后，用相同规格的打孔器在平板上取直径为0.3 cm的3块菌种接种于同一液体培养基中，静置1 d（使得菌丝适应液体生长环境），1 d后置于摇床中培养。

1.2.2 不同培养条件对液态发酵的影响

1.全场封锁，隔离病猪群，进行无害化处理病死猪彻底消毒，再进及时打扫圈舍环境卫生且将其污物、排泄物消毒后，再用复合酚浓度为1：200倍稀释消毒圈舍，用具每天2次，连续消毒3 d后改为复合酚浓度为1：300倍稀释，每天1次，连续消毒3 d。

1.2.2.1 温度对液态发酵的影响 将已接种的液体培养基分别放置在不同的摇床中培养，摇床温度分别设置为20、25、30、35℃，且每种处理重复5次，其他条件一致（装液量150 mL，摇床转速150 r/min，培养时间14 d）；发酵培养结束后，观察菌球形态，测定菌体干质量、多糖含量，探索最适培养温度。

1.2.2.2 装液量对液态发酵的影响 分别于250 mL的培养瓶中加入70、100、130、160 mL的液体培养基，灭菌后接种，置于1.2.2.1筛选的最适温度条件下振荡培养，每个处理重复5次。发酵培养结束后，观察菌球形态，测定菌体干质量、多糖含量，探索最适的装液量。

1.2.2.3 转速对液态发酵的影响 将已接种的液体培养基分别在90、120、150、180 r/min的转速下进行培养，每种处理重复5次，置于1.2.2.1筛选的最适温度和1.2.2.2筛选出的最适装液量条件下进行发酵；发酵培养结束后，观察菌球形态，测定菌体干质量、多糖含量，探索最适摇床转速。

1.2.2.4 培养时间对液态发酵的影响 将已接种的液体培养基中培养20 d，其他条件使用1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3筛选出的最优条件进行培养；从第4天开始，每隔1 d从培养基中随机取样一次，共取样5次，测定菌体干质量、多糖含量，观察菌球形态，探索最适生长周期。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 菌体干质量的测定 取一定量的发酵液，用已烘干并称质量的滤纸过滤，用水冲洗至洗液不再带有发酵液颜色为止；在60℃恒温的烘箱中干燥至恒质量，称量并记录[9]。

1.3.2 多糖的测定

1.3.2.1 多糖的粗提取 将已烘干的菌球在研钵中磨碎，过0.3 mm筛，得到雁北嗜蓝孢孔菌菌粉，称量，记录；在80℃下于恒温水浴锅中以1∶10（样品∶蒸馏水）的比例萃取样品2 h（期间萃取容器需密封防止水分蒸干），萃取结束后，冷却至室温；使用离心机于3 000 r/min离心5 min，弃去沉淀后再以相同的方式离心一次，合并2次的上提液；向提取液中加入一定量的4℃条件下预冷的无水乙醇，使混合液的醇浓度达到80%左右（加乙醇时应慢加快搅，然后将其密封防止乙醇挥发），置于4℃冰箱中冷藏过夜，使沉淀析出；从冰箱中取出后于3 000 r/min离心5 min，产生粗制的水溶性多糖，将其置于已称质量的容器中于80℃烘箱中干燥，除去水分和乙醇，得到多糖的粗提物，称量并记录。

1.3.2.2 标准曲线的绘制 分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准葡萄糖溶液装入试管中，加蒸馏水补充到2.0 mL；加入新配制好的5%苯酚溶液1 mL，摇匀；随后缓慢加入浓硫酸5 mL，摇匀，静置30 min（使其温度降低到室温）；然后在490 nm波长下测定吸光度值，绘制标准曲线，求得回归方程。

1.3.2.3 多糖含量的测定 取1.3.2.1所得的雁北嗜蓝孢孔菌多糖粗提取物，溶解，配成0.1 mg/mL的多糖溶液；取1 mL多糖溶液于具塞试管中，再分别移取1 mL蒸馏水、1 mL新配置的5%苯酚溶液和5 mL的浓硫酸，摇匀，静置30 min（使其温度降低到室温）；在490 nm波长下测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算多糖含量。

1.4 数据处理

结果中的数据均为5次测定结果的平均值；采用Excel 2007整理数据和作图，采用SPSS 20.0统计软件进行方差分析，采用Duncan法进行差异显著性比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 多糖标准曲线的绘制

图1为所得到的葡萄糖标准曲线，其中，横坐标（x）为标准溶液中葡萄糖含量（mg），纵坐标（y）为该葡萄糖含量下测得的吸光值，x与y之间的直线线性关系为y＝20.190 0x＋0.080 6（R2＝0.996），根据该的方程，可以计算多糖含量。

2.2 培养温度对雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的影响

温度是影响菌丝生长的最关键因素之一。从表1可以看出，在20～30℃温度范围内，随着温度的升高，菌体干质量以及多糖含量呈现逐渐增加的趋势，在30℃时菌体干质量、多糖含量达到最大，且显著高于其他处理；但当培养温度达到35℃时，菌体干质量、多糖含量均降为最低，且显著低于其他处理；30℃形成的菌球最多且较规则，菌球平均直径为0.3 cm。因此，雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的最适温度为30℃。

表1 培养温度对菌体干质量和多糖含量的影响

2.3 装液量对雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的影响

培养瓶中营养物质和氧气的含量由装液量的多少所决定。在相同规格的培养瓶中，随着装液量的增多，营养物质含量增加，培养瓶中的氧气含量逐渐降低。表2结果显示，于250 mL的培养瓶中，装液量为70～130 mL时，随着装液量的增多，菌体干质量和多糖含量逐渐增加，在130 mL处理下，菌体干质量、多糖含量达到最大，且显著高于70、100 mL处理，菌球越来越规则；装液量为160 mL时，其菌体干质量和多糖含量虽与装液量130 mL时无显著差异，但其菌球偏大、菌球出现不规则。因此，在250 mL培养瓶培养雁北嗜蓝孢孔菌的液体发酵的最适装液量为130 mL。

表2 装液量对雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的影响

2.4 摇床转速对雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的影响

摇床转速直接影响到培养液中的溶氧水平，转速过高形成的菌球过小甚至形不成完整的菌球，转速过低则菌球过大[10]。在液体发酵培养过程中，菌株的生长能力不仅与菌株本身的性能有关，而且还与其培养环境息息相关。因此，液体发酵过程中摇床转速有着重要的作用。从图2、3可以看出，在90～150 r/min处理下，随着转速的增加，菌体干质量、多糖含量逐渐增加，菌球逐渐分散开来，越来越规则；在120、150 r/min的摇床转速下，菌体干质量、多糖含量间差异不显著，但在150 r/min转速下菌球形态较好，菌球大小均匀。因此，雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的最适转速为150 r/min。

2.5 培养时间对雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的影响

在液体发酵培养过程中，处于一定阶段时，随着培养时间的增加，菌球的质量不断增加，但并不是培养时间越长越好。培养过程中，菌球处于封闭状态，营养物质的消耗、氧气的耗损、菌球生长过程中生存空间的缩小及其所产生的次级产物，都会影响菌球的生长。图4结果表明，在培养8 d之前，菌球生长处于延迟期，菌球质量缓慢增加；在第8～16天时，菌球处于快速生长期，菌球质量快速增长，此时菌球的生命力最为旺盛，可选用此阶段的菌球作为扩大培养的二级种，16 d以后菌球质量再次进入缓慢增长阶段。

由图5可知，培养时间对多糖含量的影响趋势与菌球生长的变化相似，培养前8 d多糖含量无显著变化；培养超过8 d，多糖含量呈显著增加趋势，至第16天多糖含量达最大值，为2.55 mg/mL；16 d之后，菌球干质量仍呈现缓慢增加趋势，但多糖含量出现了缓慢降低趋势，表明菌株已出现老化现象。因此，雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的最适生长周期为16 d。

3 结论与讨论

我国有着悠久的菌类食用和开发历史，食用菌自古就以其特殊口感和药用价值被纳入食谱和药方中[11]。近年来，随着人们对食用菌研究的不断深入，其产品的加工渠道也不断拓宽，目前食用菌深层发酵技术已被广泛应用和研究[12-13]。这些技术的发展必将为食用菌产品的研发提供技术支持。目前，食用菌多糖的开发与利用越来越受到重视，因此，本试验在以菌球形态、菌体干质量为指标的基础上增加多糖含量这一指标，使得试验结果更加贴近实际应用效果，也使得其更具有说服力。

在本试验中，液体发酵培养的最适温度为30℃，这与郭尚等[14]研究提出的雁北嗜蓝孢孔菌菌丝在25、30℃时生长速度最快相吻合。结合其子实体的生长环境、出菇时间，可判断该菌为高温菌，最适生长周期为16 d，这与刘晓钢等[15]开展的雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵试验，在时间上存在着差异，其原因可能是因为该试验并没有对生长周期进行单独的研究，只是以菌球生长到一定量的时间为一个固定界限值来探究其他因素对液体发酵的影响，其还有待进一步研究。在本试验中，液体培养基的氮源采用的是豆粕粉，在配制液体培养基时虽对其进行过滤处理，却仍存在浑浊现象，但随着菌丝培养时间的增加，培养液逐渐变得澄清，这应该是由菌丝体分解豆粕粉用以生长所致。在发酵罐规模化生产中，若培养基配方不变，是否可以根据培养液的澄清状况来辨别菌丝的生长阶段，这还有待进一步研究。另外，本试验由于时间方面的原因，仅进行了单因素试验，尚未进行多因素正交试验，探索温度、装液量、摇床转速、生长周期4个因素之间相互作用的交互模型有待进一步研究。

结合本试验的数据分析，利用液体深度发酵来生产雁北嗜蓝孢孔菌的多糖在原理上是可行的，但若要进行大规模的生产，还需进行进一步的优化。在无法进行人工驯化的前提下，该方法为雁北嗜蓝孢孔菌功能产品的开发提供了一种有效的途径，即使日后该菌突破技术难关，得以人工化栽培，液体发酵仍具有其独特的优势。一方面，液体发酵所需成本较低、污染率低，可在短时间内进行规模化生产；另一方面，液体发酵菌球取样较容易，取样过程中不需要与培养物质进行分离，不易受到外界环境中杂菌的污染，无论是进行样品数据分析、还是进行菌丝成分的提取都较简单，不需要进行复杂的处理。

本研究结果表明，在250 mL的培养瓶中，雁北嗜蓝孢孔菌的最佳发酵条件为温度30℃、装液量130 mL、摇床转速150 r/min、生长周期16 d；在此条件下培养的液体菌种，不仅菌球干质量大、多糖含量高，而且菌球形态较好、菌球大小比较均匀。