幽门螺杆菌对抗生素耐药性的多中心前瞻性分析

叶珊珊，李俊达，周应生，刘 璐，吴建维，吕志武，刘锦涛*

(1.广东医科大学宝安临床医学院 深圳市宝安区人民医院 消化内科， 广东 深圳 518101； 2.深圳市龙华区人民医院消化内科，广东 深圳 518109； 3.中国科学院大学深圳医院 消化内科，广东 深圳 518107)

幽门螺杆菌(Helicobater pylori，Hp)是人类最常见的感染性疾病的病原体，其人群感染率在全球约50%。Hp主要寄生于人的胃部，是导致胃炎、消化道溃疡、胃癌和胃MALT(mucosa-associated lymphoid tissue)淋巴瘤的病因。京都全球幽门螺杆菌胃炎共识报告(Kyoto global consensus report onHelicobacterpylorigastritis)提出所有Hp感染者都应该接受根除治疗，除了一些抗衡因素存在[1]。目前我国Hp根除成功率呈下降趋势，Hp对几种常用抗生素产生耐药性是导致根除治疗失败的主要因素。为此，本研究收集深圳市3家医院(宝安区人民医院、龙华区人民医院和中国科学院大学深圳医院)2017年2月至2019年6月消化道不适患者胃黏膜，培养分离出Hp菌株，探讨该地区Hp感染情况以及对常见的6种抗生素耐药情况，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例： 收集因上腹部不适、食欲不振、恶心、嗳气、腹胀等消化道症状就诊患者5 106例，经患者同意并签署知情同意书后，通过内镜下活取胃窦黏膜组织行Hp培养鉴定及对分离菌株进行琼脂稀释法药物敏感试验。病例排除标准：1)年龄<18岁；2)近1个月内使用过抗生素、铋剂或质子泵抑制剂；3)近1周内有疑似急性上消化道出血的症状；4)既往曾行胃部手术或肿瘤病史者；5)存在胃镜检查禁忌证；6)妊娠期或哺乳期；7)合并严重的心、肝、肾等疾病。

1.1.2 试剂：Hp尿素酶快速检测(urease rapid test)试剂盒(本溪斯特捷生物科技有限公司)；甲硝唑(metronidazole, MNZ,CN16-B066)、呋喃唑酮(furazolidone, FR,CN18-B031)、克拉霉素(clarithromycin,CAM,CN16-B122)、多西环素(doxycycline,DOX,CN16-B039)、阿莫西林(amoxicillin, AMX,CN16-B015)及左氧氟沙星(levofloxacin,LVX,CN16-B176)药敏实验纸片(OXOID公司)。

1.2 方法

1.2.1 胃镜检查与胃黏膜取样：患者禁食8 h，予盐酸利多卡因胶浆口服后行胃镜检查，在胃窦大弯、小弯侧各取黏膜组织1块，置于有0.5 mL保存液(10%蔗糖，2.8%布氏肉汤粉，10%牛血清)的离心管内，密闭，在深圳广如医学检验实验室完成Hp培养及药敏试验。

1.2.2 尿素酶快速试验：使用Hp尿素酶快速检测试剂盒。试剂盒含尿素、pH指示剂(酚红)、缓冲液和防腐剂；取胃黏膜组织1块(0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm)，将活检组织放入试剂，观察试剂的变化，若试剂酚红由黄色变为红色，说明pH升高，试验结果为阳性，提示活检组织存在Hp感染。

1.2.3Hp培养：取胃黏膜组织1块(0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm)，经匀浆器研磨后在无菌条件下接种于Hp培养基上，在37 ℃微需氧环境(10%氧气，10%二氧化碳，80%氮气)中培养3～5 d，待培养基上生长无色透明、针尖大小的菌落，即可进行显微镜观察。显微镜下观察到细菌呈革兰染色阴性，形态呈弯曲或海鸥展翅状，氧化酶和过氧化酶试验阳性，即可判断为Hp。

1.2.4 药敏试验：Hp培养鉴定阳性后，选用6种常用抗生素：MNZ、FR、CAM、DOX、AMX和LVX 进一步做抗生素敏感试验。药敏试验步骤：经鉴定后的典型菌落接种在含5%羊血清的Mueller-Hinton M琼脂培养基上。采用 Kirby-Bauer 药敏纸片法，根据抑菌环直径分为耐药、中介、敏感。判断标准：耐药，无抑菌圈；低敏,抑菌圈≤7 mm；中敏,7 mm<抑菌圈<15 mm；高敏,抑菌圈≥15 mm。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Hp感染检测结果

5 080例患者中Hp分离培养阳性共3 209例，快速尿速酶试验阳性共3 208例，取两项结果均阳性病例共3 203例，阳性率为63.05%，其中男性1 992例(62.2%)，女性1 211例(37.8%)，年龄18～88岁，平均年龄(39.78±11.69)岁。各年龄层次人群的Hp感染情况：18～30岁，74.37%(827/1 112)；31～40岁，66.14%(971/1 468)；41～50岁，58.62%(792/1 351)；51～60岁，55.13%(435/789)；>60岁，49.44%(178/360)。

2.2 Hp对6种抗生素耐药情况

3 203例Hp菌株对6种抗生素耐药率分别是MNZ 99.6%、FR 0.2%、CAM 10.6%、DOX 0.3%、AMX 30.5%和LVX 0.1%(图1)。

2.3 Hp对抗生素均敏感，单一、双重和多重耐药情况

3 203例临床分离菌株中，对6种抗生素均敏感的菌株占0.18%，单一耐药菌株占62.06%，双重耐药菌株占33.94%，多重耐药菌株占3.81%(图1)。

图1 Hp对6种抗生素的耐药情况(包括单一、双重及多重)Fig 1 Drug resistance of Hp in patients to six kinds of antibiotics (single, double and multiple)

2.4 不同性别的患者Hp对抗生素耐药情况

女性患者对CAM的耐药率显著高于男性患者(P<0.05)；其余5种抗生素在不同性别的耐药率相近(表1)。男性患者Hp对抗生素单一耐药率显著高于女性患者(P<0.05)；女性患者Hp对抗生素双重耐药率显著高于男性患者(P<0.05)；不同性别Hp对抗生素均敏感和多重耐药的耐药率无明显差异(表2)。

表1 不同性别的患者Hp对6种抗生素耐药情况

表2 不同性别的患者Hp对6种抗生素均敏感,单一、双重和多重耐药情况

2.5 不同年龄段的患者Hp对抗生素耐药情况

比较≤40岁和>40岁两个年龄段患者Hp对6种抗生素耐药情况，>40岁患者Hp对AMX耐药率显著高于≤40岁患者(P<0.05)；其余抗生素在两个年龄段耐药率相近(表3)。≤40岁患者Hp对抗生素均敏感和单一耐药率显著高于>40岁患者(P<0.05)；>40岁患者Hp双重耐药率显著高于≤40岁患者(P<0.05)；不同年龄段患者Hp对抗生素多重耐药的耐药率无明显差异(表4)。

表3 不同年龄段的患者Hp对6种抗生素耐药情况

表4 不同年龄段的患者Hp对6种抗生素均敏感,单一、双重和多重耐药情况

3 讨论

我国是Hp高感染率国家，达到55.82%，感染人口接近8亿[2]。研究证实一旦感染Hp，不经治疗难以自愈。近年,随着Hp对抗生素的耐药性逐渐增加，Hp根除率随之下降。

MNZ经过硝基和超氧自由基作用后产生抗菌效果。研究认为[3]， rdxA基因编码一种氧合NADPH

(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)的硝基还原酶是导致Hp对MNZ产生耐药的主要原因。此外,有研究提出[4]，frxA (编码NADPH黄素氧化还原酶)和fdxB (编码铁氧还蛋白样蛋白)的失活也可能诱导Hp对MNZ产生耐药性。最近，有报道过量的MNZ增加了RND(resistance-nodulation-cell division)外排泵的外膜蛋白(TolC)同源基因表达水平，从而产生Hp菌株对MNZ耐药[5]。在发展中国家，MNZ耐药率通常较高，中国高达95.4%[6]，越南为69.9%[7]，马来西亚为75.5%[8]，这可能与该抗生素成本廉价且容易获得有关。另外该地区Hp对含MNZ双重及多重耐药情况较严重，尤其在≤40岁患者，这可能与MNZ频繁用于寄生虫感染、牙周感染和年轻女性妇科感染治疗有关。有研究Hp对二级抗生素耐药性的危险因素，认为年龄是MNZ及其双重感染继发耐药性的独立预测因子，可能与感染持续时间较长，以及更早接触抗生素有关[9]。虽然MNZ耐药性对Hp根除率的影响可能通过增加剂量和治疗时间得到部分获益，但在高耐药率情况下，如果没有药敏试验作为前提，MNZ不应推荐作为一线抗生素使用。同时，建议根除治疗时尽量避免同时使用以上几种高耐药性抗生素，可以考虑联合铋剂或延长疗程在一定程度上提高Hp根除率；新型钾离子竞争性酸阻断剂的出现有望进一步提高Hp根除率。

综上所述，Hp的治疗仍然是个未解决的问题。事实上，没有一种治疗方案能够完全根除所有Hp，即使连续几次接受标准根除治疗，仍有部分患者未能根除成功。治疗失败归因于Hp对抗生素耐药性的增加。因此，针对该地区Hp阳性患者，建议临床医生在没有药敏试验结果的情况下，尽量避免使用含MNZ双重耐药抗生素，首选低耐药的DOX、FR、LVX作为初次根除方案，提高初次根除成功率。