新型冠状病毒S蛋白RBD的糖基化及其长度对蛋白疫苗免疫原性的影响

张 婷，王志荣，许雪梅

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物物理及结构生物学系， 北京 100005)

鉴于目前尚无新型冠状病毒(severe acute respiratory coronavirus 2, SARS-CoV-2)特效治疗药物，疫苗是控制SARS-CoV-2大流行的关键措施。目前已有多种不同形式的疫苗进入临床试验[1]，包括灭活疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗及蛋白疫苗，其中蛋白疫苗诱发产生的中和抗体水平较高[2]。迄今上市的采用非传统技术生产的疫苗均为蛋白疫苗，如乙肝病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗、HPV VLP疫苗、带状疱疹病毒糖蛋白疫苗及流感蛋白疫苗，该类疫苗安全性好，且在诱发中和抗体方面具有优势。

SARS-CoV-2为有包膜的正链RNA病毒，与SARS-CoV及中东呼吸道综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)同属冠状病毒β属，均可诱发急性呼吸系统综合征，其中SARS-CoV-2和SARS-CoV的同源性很高[3]。病毒有4种结构蛋白(S、M、N、E)，其中S蛋白是感染入侵的关键蛋白，以三聚体形式分布在包膜表面，其N端含有细胞受体结合域(receptor binding domain, RBD)，是冠状病毒疫苗研究的主要靶抗原[4]。RBD与宿主细胞的血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)结合后，S蛋白发生变构，启动病毒感染入侵[5-6]。SARS-CoV-2的S蛋白高度糖基化，其RBD中至少有4个潜在糖基化位点[7]。目前，SARS-CoV-2的S蛋白糖基化水平对其免疫原性的影响尚不清楚。

SARS-CoV的病毒学及疫苗学研究为SARS-CoV-2疫苗的研发提供了有力的技术支持。首先，研究发现，与SARS-CoV一样，SARS-CoV-2的S蛋白融合前状态的维持也有利于RBD依赖的中和抗体的诱发。目前，进入临床试验的以S全长蛋白为基础的不同形式SARS-CoV-2疫苗均采用可保持融合前状态的S蛋白突变体基因(S-2P)[2,8]，即将aa.986-987置换为2个脯氨酸。其次，SARS-CoV的研究发现，单独表达RBD片段也可诱发高滴度的中和抗体和保护反应[9-10]，且不受S蛋白融合前状态的限制。与全长S蛋白相比，RBD片段的长度适中，易于改造和在多种不同表达体系进行高水平的表达及纯化。目前分离了多种RBD依赖的中和单抗[11-12]，其识别表位是构象依赖的，表明RBD的中和表位具有一定的空间构象，其旁侧序列对表位构象的维持可能有一定的影响，目前有关不同长度RBD的报道较少。

酵母及CHO细胞表达SARS-CoV的RBD(aa.318-536)蛋白的研究目前已有报道[10,13]，尚未见在昆虫表达体系的报道。昆虫细胞表达体系具有表达量高、易于悬浮培养、操作简单、表达蛋白的糖基化与哺乳动物接近等优点，特别适于真核来源的蛋白表达。本研究采用三聚体蛋白疫苗的形式，利用杆状病毒-昆虫细胞表达体系，表达获得3种不同的去除N-糖基化残基的SARS-CoV-2 RBD(aa.331-550)蛋白及糖基化位点正常的2种不同长度的RBD蛋白。结果显示，N-糖基化的去除可提高RBD三聚体蛋白在昆虫细胞中的表达水平，且免疫原性不受影响，长片段的RBD三聚体蛋白的免疫原性比短片段的好。

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞(本实验室保存)；Huh-7细胞(中国医学科学院基础医学研究所刘力教授惠赠)；草地夜蛾卵巢细胞Sf9、E.coliDH10Bac(Invitrogen公司)；原核表达的RBD蛋白(中国科技大学金腾川教授惠赠)；含G蛋白缺陷骨架的VSV病毒(本实验室构建)；pcDNA3.1-hS质粒(本实验室构建)；His标签抗体(OriGene公司)；HisTrapTM HP预装柱(GE公司)；氢氧化铝凝胶佐剂、MPL佐剂(InvivoGen公司)；雌性Balb/c小鼠30只[斯贝福(北京)生物技术有限公司，合格证号:1103242011001338]。

1.2 方法

1.2.1 RBD融合基因重组穿梭质粒Bacmid的构建:在SARS-CoV-2 S蛋白序列(GenBank序列号为QHD43416.1)氨基酸319-591位(aa.319-591)或氨基酸331-550位(aa.331-550)的N端融合杆状病毒包膜糖蛋白gp64的信号肽序列(GenBank序列号为AIU56980.1，aa.1-38)，C端融合T4噬菌体三聚化结构域(PDB序列号为1AVY_A，aa.45-71)，并在下游进一步融合His标签序列(8个组氨酸)，分别获得长片段的RBDST融合蛋白及短片段的RBDT融合蛋白。在RBDT的基础上，删除N331氨基酸，获得RBDT-N1融合蛋白；进行N343S突变，获得RBDT-N2融合蛋白；进行N360A突变，获得RBDT-N3融合蛋白。根据 Sf9 偏性密码子对上述RBD蛋白的基因序列进行优化，合成获得的RBD融合基因分别插入 pFastBac1 载体，转化DH10Bac感受态，PCR鉴定获得重组Bacmid，提取备用。

1.2.2 RBD蛋白的表达及鉴定:将携带RBD融合基因的重组Bacmid转染Sf9细胞，构建重组杆状病毒，感染Sf9细胞后(MOI=0.1)，27 ℃培养约88 h，离心收集培养上清。12% SDS-PAGE及Western blot分析培养上清中的RBD蛋白表达情况。一抗为His标签抗体，二抗为 HRP标记的羊抗小鼠IgG。

1.2.3 RBD蛋白的纯化:表达不同RBD融合蛋白的培养上清在PBS中4 ℃透析24 h，经HisTrapTMHP亲和层析纯化，按GE公司说明书中提供的纯化方案纯化融合蛋白。

1.2.4 小鼠免疫:4～6周雌性Balb/c小鼠5只/组，RBD融合蛋白抗原10 μg/剂，联合50 μg/剂的氢氧化铝佐剂及5 μg/剂的MPL佐剂，于第 0、3、6周皮下免疫，设PBS免疫小鼠为对照组，于第5、8周尾静脉采集血清。

1.2.5 ELISA检测血清中RBD特异性IgG抗体水平:用PBS将原核表达的RBD蛋白稀释至1 μg/mL，包被96孔板(100 μL/孔)；使用5% BSA封闭(200 μL/孔)；用PBS倍比稀释待测血清，加入96孔板，4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h；OPD底物显色(100 μL/孔)，37 ℃反应5 min；2 mol/L硫酸(50 μL/孔)终止反应；检测A490。A490数值大于0.2且大于阴性对照2倍的最大血清稀释度视为特异性IgG抗体滴度。

1.2.6 假病毒的制备:制备方法如文献所述[14]，使用S蛋白表达质粒pcDNA3.1-hS转染293T细胞，37 ℃培养24 h后，用含G蛋白缺陷骨架的VSV病毒感染细胞(MOI=4)，37 ℃培养48 h。收集培养上清，检测假病毒的滴度。

1.2.7 假病毒中和实验:如文献所述[14]，使用DMEM完全培养基稀释假病毒，将稀释后的假病毒与倍比稀释的待测血清等体积混合，4 ℃孵育1 h，然后加入预先铺好的Huh-7细胞中(2×104个/100 μL/孔，MOI=0.05)。37 ℃孵育24 h，使用流式细胞仪检测各孔细胞的感染抑制率。感染抑制率=(1-待测血清样品中的荧光细胞百分数/阴性对照样品中的荧光细胞百分数)×100%。感染抑制率大于50%的最高稀释倍数即为中和抗体滴度。

1.3 统计学分析

使用Graphpad软件分析实验数据并作图，ELISA抗体及中和抗体水平以平均滴度(GMT)±SD表示。

2 结果

2.1 RBD蛋白的表达鉴定

取等体积(60 μL)相同表达条件的各种RBD蛋白的表达上清进行12% SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示，5种RBD蛋白均可在Sf9细胞中分泌表达，其中RBDST的分子质量约40 ku(图1，泳道1)，其余4种RBD蛋白的分子质量约37 ku(图1，泳道2-5)，上述5种RBD蛋白的表观分子质量均大于理论值，提示RBD蛋白在昆虫细胞中表达时发生了糖基化。值得注意的是，3种去糖基化的蛋白RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3的表达水平均高于RBDT(图1，泳道2-5)，提示糖基化的去除可提高RBD蛋白在昆虫细胞中的表达水平。

1.RBDST; 2.RBDT; 3.RBDT-N1; 4.RBDT-N2;5.RBDT-N3; 6.control medium图1 Western blot分析Sf9表达上清中的RBD蛋白Fig 1 Western blot analysis of RBD proteins in the culture media of Sf9 cells

2.2 去糖基化的RBD蛋白免疫血清RBD特异性IgG水平分析

为明确去糖基化对RBD蛋白免疫活性的影响，本研究比较了RBDT与3种去糖基化蛋白RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3诱发的RBD特异性IgG水平。结果显示，2次免疫后各组的RBD特异性IgG滴度在320～560，3次免疫后各组的特异性IgG滴度在6 400～11 200，组间均无统计学差异(图2)。PBS对照组未检测到RBD特异性IgG。

图2 糖基化不同的RBD蛋白诱发的血清特异性IgG抗体水平分析Fig 2 Analysis of RBD-specific IgG titers induced by RBD proteins with different glycosylation

2.3 不同长度的RBD蛋白免疫血清RBD特异性IgG水平分析

为明确片段长度对RBD蛋白免疫活性的影响，本研究比较了较短的RBDT与较长的RBDST诱发的RBD特异性IgG抗体水平。结果显示，2次免疫及3次免疫后，RBDST诱发的特异性IgG滴度分别为880和33 280，均显著高于RBDT免疫组(P<0.05，P<0.01)(图3)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with RBDT group图3 不同长度的RBD蛋白诱发的血清特异性IgG抗体水平分析Fig 3 Analysis of RBD-specific IgG titers induced by RBD proteins with different length

2.4 RBD蛋白免疫血清中和抗体水平分析

本研究采用VSV骨架的SARS-CoV-2假病毒检测各组RBD蛋白3次免疫后的血清中和抗体水平。结果显示，RBDST诱发的中和抗体滴度最高，显著高于RBDT(P<0.01)及3种去糖基化的RBD蛋白(P<0.001)诱发的中和抗体(图4)。

*P<0.01,**P<0.001 compared with RBDST group图4 RBD蛋白诱发的SARS-CoV-2假病毒中和抗体分析Fig 4 Analysis of SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization titers induced by RBD

3 讨论

杆状病毒-昆虫细胞表达体系具有表达水平高、安全性好、易于操作等优点。目前利用该体系生产获批上市的疫苗有HPV VLP疫苗、甲状腺癌治疗性蛋白疫苗及赛诺菲巴斯德的四价流感蛋白疫苗。研究发现，Sf9昆虫细胞表达的SARS-CoV RBD蛋白(aa.318-510)诱发的中和抗体滴度显著高于原核表达的[15]。本研究采用昆虫细胞表达体系对RBD(aa.331-550)的不同糖基化敲除突变体及两种不同长度的RBD蛋白进行表达，分析其免疫原性。结果显示，分别去除N331、N343和N360糖基化均可提高蛋白在昆虫细胞中的表达水平而不影响其免疫原性。SARS-CoV-2 RBD(aa.319-545)蛋白糖基化位点分析的结果[16]显示，N331、N343位点位于RBD受体结合基序结构的基部，即这2个位点不参与结合ACE2。本研究的3个糖基化位点中，N331和N343为典型的糖基化位点基序(NXT/Y)[7,17]，N360为尚未确认的潜在糖基化位点。本研究获得的3个去糖基化的突变体免疫原性没有改变，可能是由于这些位点不在与ACE2结合的基序中。但采用SARS-CoV-2假病毒变异株的体外分析显示，N331突变增加了突变株对康复者血清的敏感性[18]，因此N331突变株的抗原性值得深入研究；另外，酵母表达的去糖基化的SARS-CoV RBD蛋白分析[13]显示，去除N331同源的糖基化位点后，其表达水平显著降低，免疫血清的中和抗体水平(假病毒中和抗体水平不变，真病毒中和抗体水平显著提高)有待于进一步分析，而另2个突变体(N343、N360同源位点去糖基化)的表达极低，没有深入研究，这可能是采用的实验评价方法或表达体系不同造成的。本研究还发现，RBD长片段(aa.319-591)的免疫原性较短片段(aa.331-550)的高。结构分析显示，SARS-CoV-2 S蛋白的RBD区为aa.319-541区域，其中aa.437-508区域为受体结合基序(receptor binding motif，RBM)。在SARS-CoV的前期研究中发现，包含RBM的不同长度的RBD片段均可诱发中和抗体，目前SARS-CoV报道的RBD蛋白有2种长度，即193个氨基酸(aa.318-510)[9,13]和219个氨基酸(aa.318-536)[10,13]。最近又报道了两种不同长度的RBD蛋白疫苗，分别是长度为227个氨基酸的SARS-CoV-2 RBD (aa.319-545)蛋白疫苗[16]，及长度为223个氨基酸的RBD(aa.319-541)单链二聚体的蛋白疫苗[19]。本课题组目前正在进一步比较这些不同长度RBD蛋白的免疫原性，同时进行去糖基化长片段RBD的研究。

理想的疫苗需同时诱发体液及细胞免疫反应，体液免疫的评价主要检测保护性抗体。康复者血清及S蛋白依赖的中和抗体的被动免疫试验证明，中和抗体在阻断病毒感染中起重要作用[20-22]。目前新冠疫苗研发免疫活性的指标主要是对抗体水平进行分析，因此本研究重点分析三聚体蛋白诱发的特异性IgG及中和抗体水平。结果显示，RBD三聚体诱发的IgG抗体最高可达104，中和抗体水平较IgG抗体低1个数量级。有文献报道的SARS-CoV-2疫苗的ELISA抗体滴度较高(可达105)，但其与假病毒中和抗体滴度的比值也很高(100:1)[16,19]，有些文献报道的ELISA滴度相对较低，但其与假病毒中和抗体的滴度比值较低(约10∶1)[2]，这主要是不同研究采用的试验体系不同造成的，影响因素主要包括假病毒体系的不同(假病毒的骨架、S蛋白的密度)、分析用细胞系的不同等。因此，目前SARS-CoV-2疫苗的临床研究中经常用康复者血清的中和抗体滴度作为参照。在本研究基础上，本课题组将深入系统地优化RBD蛋白的结构及组成方式，进一步筛选产量高、免疫原性强的蛋白疫苗，届时将全面分析疫苗诱发的细胞免疫、体液免疫及体内保护活性。

总之，本研究发现，SARS-CoV-2 RBD去糖基化修饰可提高其在昆虫细胞中的表达水平，同时又不影响其免疫原性；较长片段的RBD蛋白疫苗(aa.319-591)免疫活性优于短片段的RBD蛋白疫苗。研究结果不仅可用于蛋白疫苗的研究，也可用于基于RBD蛋白抗原的病毒载体疫苗及核酸疫苗。