毛蕊异黄酮对脑缺血/再灌注大鼠神经细胞凋亡的影响

张彐宁，高维娟，周晓红，靳晓飞

(河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

脑缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)损伤由缺血脑组织恢复血流供应所引起，是缺血性脑卒中治疗过程中产生的病理性损伤[1]，凋亡在其病理进程中发挥了重要作用。毛蕊异黄酮是中药黄芪的有效活性成分，是一种潜在的神经保护剂[2]，本研究旨在探讨毛蕊异黄酮对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级SD大鼠60只，♂，体质量280±20 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0011。

1.2 主要试剂毛蕊异黄酮(上海士峰生物制品有限公司)；MCAO栓线(北京西浓科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)；甲苯胺蓝染液、BCA 蛋白测定试剂盒(Solarbio)；尼莫地平、Bax和Bcl-2抗体(Servicebio)；caspase-3抗体(CST)；TUNEL染色试剂盒(Promega)。

1.3 主要仪器组织包埋机、切片机(Leica)；倒置荧光显微镜(Carl Zeiss)；多功能成像系统(Vilber)。

1.4 实验分组与模型制备参照文献[3]的方法造模，根据Zea Longa 评分标准，1～3分者为造模成功，列为实验对象。大鼠随机分为：假手术组、模型组、毛蕊异黄酮低、中、高剂量组(5、10、20 mg· kg-1，Calycosin)，采用TTC、HE和尼氏染色，观察毛蕊异黄酮对脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用，筛选出毛蕊异黄酮最佳治疗剂量，之后将大鼠随机分为：假手术组、模型组、毛蕊异黄酮组(Calycosin，20 mg· kg-1)、尼莫地平组(Nimodipine，0.7 mg· kg-1，阳性对照药组)，采用TUNEL染色和Western blot检测各组大鼠神经细胞凋亡情况。各给药组于再灌注的同时腹腔注射相应剂量药物，给药体积8 mL· kg-1，假手术组和模型组等体积腹腔注射生理盐水。

1.5 TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积造模给药结束后，断头取脑，做冠状位切片，用2% TTC染液恒温避光孵育30 min，拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析图片并计算脑梗死体积。

1.6 HE染色观察各组大鼠神经细胞病理形态学改变各组切片脱蜡至水，苏木精浸染5～8 min，流水冲洗，盐酸酒精分色，伊红浸染1～3 min，自来水浸洗，最后脱水透明封片，倒置显微镜下观察并拍照。

1.7 尼氏染色检测各组大鼠神经细胞尼氏体平均光密度值各组切片脱蜡至水，用1%甲苯胺蓝恒温避光孵育30 min，最后脱水透明封片，倒置显微镜下观察并拍照。

1.8 TUNEL染色检测各组大鼠神经细胞凋亡情况按照试剂盒说明书，将各组切片利用蛋白酶K处理20 min，利用TUNEL反应混合液于37 ℃室温避光孵育1 h。TUNEL阳性细胞在荧光显微镜下观察成像。

1.9 Western blot检测各组大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达各组蛋白样品经电泳转膜封闭后，分别用Bax、Bcl-2、caspase-3、β-actin一抗与膜上的抗原结合，4 ℃过夜，TBST洗去一抗，然后加入相应二抗与其反应，多功能成像系统下扫描成像。

2 结果

2.1 TTC染色检测脑梗死体积的结果与Sham组相比，Model组大鼠TTC染色白色缺血区明显，有明显的梗死灶形成(P<0.05)；与Model组相比，毛蕊异黄酮低、中、高剂量组脑梗死体积均有所减小(P<0.05)，其中以高剂量组最为明显。见Tab 1。

Tab 1 Effects of calycosin on cerebral infarction volume and Nissl body in

2.2 HE染色观察神经细胞病理形态的结果与Sham组相比，Model组细胞皱缩，核固缩、深染，神经细胞生长状态较差；与Model组相比，毛蕊异黄酮低、中、高剂量组神经细胞生长状态明显好转，其中以高剂量组最为明显。

2.3 尼氏染色检测各组大鼠尼氏体平均光密度值的结果与Sham组相比，Model组细胞皱缩，轮廓模糊不清，尼氏体明显减少，并且平均光密度值明显降低(P<0.05)。与Model组相比，毛蕊异黄酮低、中、高剂量组尼氏体明显增多，平均光密度值明显增加(P<0.05)，其中以高剂量组最为明显。见Tab 1。

2.4 TUNEL染色检测神经细胞凋亡的结果与Sham组相比，Model组凋亡神经细胞明显增多(P<0.05)。与Model组相比，Calycosin组和Nimodipine组凋亡神经细胞明显减少(P<0.05)。见Tab 2。

Tab 2 Effects of calycosin on apoptosis and apoptotic proteins

2.5 Western blot检测各组大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达的结果与Sham组相比，Model组促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表达明显升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P<0.05)；与Model组相比，Calycosin组和Nimodipine组促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表达明显降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显升高(P<0.05)。见Tab 2。

3 讨论

细胞凋亡在脑缺血/再灌注病理进程中扮演了重要角色，脑缺血/再灌注引起的神经细胞死亡方式主要以细胞凋亡为主[4-5]，有效抑制细胞凋亡对于减轻脑缺血/再灌注损伤具有重要意义。本研究发现， 脑缺血/再灌注损伤后，脑梗死体积明显增大，神经细胞明显收缩，胞核深染固缩，尼氏体明显减少，凋亡神经细胞明显增多，促凋亡蛋白Bax 、caspase-3表达明显增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少。当给予毛蕊异黄酮处理后，脑缺血/再灌注大鼠脑梗死体积明显减少，细胞状态明显改善，尼氏体明显增多，凋亡神经细胞明显减少，促凋亡蛋白Bax、caspase-3表达明显降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显升高。本研究初步表明毛蕊异黄酮可减小脑梗死体积，抑制神经细胞凋亡，减轻脑缺血/再灌注损伤，其分子机制与毛蕊异黄酮调控凋亡关键蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表达密切相关。